document_id
int32 185
2.68k
| context
stringlengths 3.05k
75.2k
| question
stringlengths 9
228
| is_impossible
bool 1
class | id
int32 225
5.32k
| answers
dict | answer
stringlengths 1
913
|
|---|---|---|---|---|---|---|
630
|
Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplásmica N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.
|
¿Cuál es la causa principal de la infección por el VIH-1 en los niños?
| false
| 262
|
{
"text": [
"Mother-to-child transmission (MTCT) is the main cause of HIV-1 infection in children worldwide."
],
"answer_start": [
370
]
}
|
La transmisión de madre a hijo es la principal causa de infección por el VIH-1 en niños de todo el mundo.
|
630
|
Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) (p En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integrina (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integradora (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplasmática N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.
|
Qué desempeña el papel crucial en la transmisión del VIH-1 de la madre al hijo y qué aumenta el riesgo
| false
| 276
|
{
"text": [
"DC-SIGNR plays a crucial role in MTCT of HIV-1 and that impaired placental DC-SIGNR expression increases risk of transmission."
],
"answer_start": [
2003
]
}
|
DC-SIGNR juega un papel crucial en la transmisión del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR de la placenta deteriorada aumenta el riesgo de transmisión.
|
630
|
Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplásmica N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.
|
¿Cuántos niños fueron infectados por el VIH-1 en 2008-2009, en todo el mundo?
| false
| 278
|
{
"text": [
"more than 400,000 children were infected worldwide, mostly through MTCT and 90% of them lived in sub-Saharan Africa."
],
"answer_start": [
2291
]
}
|
Más de 400.000 niños estaban infectados en todo el mundo, principalmente a través de la transmisión de madre a hijo y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana.
|
630
|
Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) (p En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integrina (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integradora (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplasmática N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.
|
¿Cuál es el papel de C-C Motif Chemokine Ligand 3 Like 1 (CCL3L1) en la transmisión del VIH-1 de madre a hijo?
| false
| 316
|
{
"text": [
"High copy numbers of CCL3L1, a potent HIV-1 suppressive ligand for CCR5, are associated with higher chemokine production and lower risk of MTCT of HIV-1 among South African infants"
],
"answer_start": [
28143
]
}
|
El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, se asocia con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de transmisión del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos
|
630
|
Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplásmica N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.
|
¿Qué es DC-GENR y dónde se expresa?
| false
| 305
|
{
"text": [
"Dendritic cell-specific ICAM-grabbing non-integrin-related (DC-SIGNR, also known as CD209L or liver/lymph node-specific ICAM-grabbing non-integrin (L-SIGN)) can interact with a plethora of pathogens including HIV-1 and is expressed in placental capillary endothelial cells"
],
"answer_start": [
3207
]
}
|
Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integrina (DC-SIGNR, también conocida como CD209L o ICAM no integradora específica de los ganglios hepáticos/linfa) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresan en células endoteliales capilares placentarias.
|
630
|
Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplásmica N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.
|
¿Cómo afecta la presencia de DC-SIGNR a la TCM del VIH-1?
| false
| 306
|
{
"text": [
"the presence of DC-SIGNR at the placental endothelial cell surface may protect infants from HIV-1 infection by capturing virus and promoting its degradation/presentation."
],
"answer_start": [
28910
]
}
|
la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los lactantes de la infección por VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación.
|
630
|
Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplásmica N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.
|
¿Por qué los bajos niveles de DC-SIGNR mejoran la transmisión maternoinfantil del VIH-1?
| false
| 307
|
{
"text": [
"in placenta containing low levels of DC-SIGNR, HIV-1 would preferentially binds CCR5 on endothelial cells resulting in a loss of placental barrier integrity and enhanced passage of maternal HIV-1-infected cells in foetal circulation leading to MTCT of HIV-1"
],
"answer_start": [
29090
]
}
|
en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en las células endoteliales, lo que provoca una pérdida de la integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal, lo que conduce a la transmisión del VIH-1 a través de la TCM
|
630
|
Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplásmica N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.
|
¿Cuál es el porcentaje de transmisión del VIH-1 de madre a hijo cuando no hay intervención?
| false
| 277
|
{
"text": [
"Without specific interventions, the rate of HIV-1 mother-tochild transmission (MTCT) is approximately 15-45%"
],
"answer_start": [
2137
]
}
|
Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45%
|
630
|
Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) (p En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integrina (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integradora (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplasmática N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.
|
¿Afecta la transmisión del VIH-1 el receptor de la quimiocina C-C tipo 5 (CCR5)?
| false
| 312
|
{
"text": [
"Genetic variants in CCR5 have been shown to influence vertical transmission of HIV-1. CCR5 promoter variants resulting in higher expression of the receptor were associated with increased risk of MTCT of HIV-1 among sub-Saharan Africans"
],
"answer_start": [
27719
]
}
|
Se ha demostrado que las variantes genéticas en la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que dieron lugar a una mayor expresión del receptor se asociaron con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos
|
630
|
Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) La variante En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integrador (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplásmica N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.
|
¿Cómo afecta Mannanose Binding Lectin (MBL) a la eliminación del patógeno VIH-1?
| false
| 318
|
{
"text": [
"Mannose-binding lectin (MBL) is an innate immune receptor synthesised in the liver and secreted in the bloodstream in response to inflammation signal. MBL promotes pathogen elimination by opsonization and phagocytosis,"
],
"answer_start": [
28335
]
}
|
La lectina de unión a manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y secretado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación.
|
630
|
Las variantes genéticas funcionales en DC-SIGNR están asociadas con la transmisión del VIH-1 de madre a hijohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211Licencia:cc-byAbstract: ANTECEDENTES: La transmisión de madre a hijo (MTCT) es la principal causa de infección por VIH-1 en niños de todo el mundo. Dado que el receptor de lectina de tipo C, el receptor de lectina dendrítico específico para células ICAM no relacionado con la integración (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ganglio hepático/linfa-nodo específico para ICAM no integrador (L-SIGN)), puede interactuar con patógenos incluyendo el VIH-1 y se expresa en la interfaz materno-fetal, se hipotetiza que podría influir en la TCM del VIH-1. MÉTODOS Y INDICACIONES: Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, realizamos un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de 197 madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Harare, Zimbabwe. Los lactantes que albergaban dos copias de los haplotipos DC-SIGNR H1 y/o H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) tuvieron un aumento de 3,6 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el útero (UI) (P = 0,013) y un aumento de 5,7 veces el riesgo de infección por VIH-1 en el intraparto (IP) (P = 0,025) después de ajustarse para varios factores maternos. Los haplotipos H1 y H3 implicados comparten dos polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en la región promotora (p-198A) e intron 2 (int2-180A) que se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (P = 0,045 y P = 0,003, respectivamente) e IP (P = 0,025, para la infección por VIH-1) (p En los lactantes homocigotos H1 con mutaciones tanto p-198A como int2-180A, observamos una disminución de 4 veces en el nivel de transcripciones DC-SIGNR placentarias, afectando desproporcionadamente la expresión de isoformas ligadas a la membrana en comparación con las no portadoras infantiles (P = 0,011). CONCLUSIÓN: Estos resultados sugieren que DC-SIGNR juega un papel crucial en la TCM del VIH-1 y que la expresión DC-SIGNR placentaria alterada aumenta el riesgo de transmisión. Texto: Sin intervenciones específicas, la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo (TCMM) es de aproximadamente 15-45% [1]. ONUSIDA estima que solo el año pasado, más de 400.000 niños fueron infectados en todo el mundo, principalmente a través de la TCM y el 90% de ellos vivían en el África subsahariana. En los países más afectados, como Zimbabwe, el La TCM del VIH-1 puede ocurrir durante el embarazo (in utero, UI), el parto (intraparto, IP) o la lactancia materna (postparto, PP). La alta carga viral materna, el bajo recuento de células CD4, el parto vaginal, la baja edad gestacional se han identificado como factores independientes asociados con la TCM del VIH-1 [1]. Aunque los antirretrovirales pueden reducir la TCM al 2%, el acceso limitado a diagnósticos y medicamentos oportunos en muchos países en desarrollo limita el impacto potencial de esta estrategia. Una mejor comprensión de los mecanismos que actúan en la interfaz materno-fetal es crucial para el diseño de intervenciones alternativas a la terapia antirretroviral para la prevención de la transmisión. Las células dentríticas específicas de la ICAM no relacionadas con la integrina (DC-SIGNR, también conocido como CD209L o ICAM no integradora (L-SIGN)) pueden interactuar con una plétora de patógenos incluyendo VIH-1 y se expresa en células endoteliales capilares placentarias [2]. DC-SIGNR se organiza en tres dominios distintos, una cola citoplasmática N-terminal, una región de repetición que contiene siete repeticiones de 23 aminoácidos y un dominio C-terminal implicado en la unión de patógenos. El empalme alternativo del gen DC-SIGNR conduce a la producción de un repertorio de isoformas altamente diversificadas que incluye isoformas asociadas a la membrana y solubles [3]. Se ha propuesto que la interacción entre DC-SIGNR y VIH-1 podría mejorar la transferencia viral a otros tipos de células sensibles [2] pero DC-SIGNR también puede internalizar y mediar la degradación dependiente de proteasomas de virus [4] que pueden afectar de manera diferente el resultado de la infección. Dada la presencia de DC-SIGNR en la interfaz materno-fetal y su interacción con el VIH-1, se hizo una hipótesis de que podría influir en la TCM del VIH-1. Para investigar el papel potencial de DC-SIGNR en la TCM del VIH-1, se llevó a cabo un estudio de asociación genética de DC-SIGNR en una cohorte bien caracterizada de madres infectadas por el VIH y sus bebés reclutados en Zimbabwe, y se identificaron variantes específicas de DC-SIGNR asociadas con el aumento de los riesgos de transmisión del VIH. Además, caracterizamos el impacto funcional de estas variantes genéticas en la expresión DC-SIGNR y demostramos que afectan tanto al nivel como al tipo de transcripciones DC-SIGNR producidas en la placenta. Las muestras consistieron en extractos de ADN almacenados obtenidos de 197 parejas madre-hijo co-inscritas inmediatamente después del parto en el ensayo de suplementación de vitamina A de ZVITAMBO (Harare, Zimbabwe) y seguidos a 6 semanas e intervalos de 3 meses hasta 24 meses. El proyecto ZVITAMBO fue un ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo que incluyó a 14.110 parejas madre-hijo, entre noviembre de 1997 y enero de 2000, con el objetivo principal de investigar el impacto de la suplementación inmediata de vitamina A de postparto en la TCM del VIH-1. Las muestras utilizadas en el presente estudio fueron de parejas madre-hijo asignadas aleatoriamente al grupo placebo del proyecto ZVI La profilaxis antirretroviral para mujeres embarazadas VIH-1 positivas no estaba disponible en el sector público de Harare durante el reclutamiento de pacientes de ZVITAMBO. Las muestras fueron obtenidas consecutivamente de dos grupos: 97 parejas de madres VIH-1 positivas/hijos VIH-1 positivos y 100 parejas de madres VIH-1 positivas/niños VIH-negativos. El estado serológico de la madre fue determinado por ELISA y confirmado por Western Blot. Se consideró que los lactantes estaban infectados si eran seropositivos a los 18 meses o mayores y tenían dos o más resultados positivos de reacción en cadena de la polimerasa del VIH-1-DNA (PCR) a edades más tempranas. Se consideró que 100 niños no estaban infectados por ser ELISA negativos a los 18 meses o mayores y tuvieron dos resultados negativos de PCR de ADN de muestras recogidas a una edad más temprana. De los 97 niños infectados por el VIH-1, 57 fueron infectados IU, 11 fueron infectados IP y 17 fueron infectados PP según los análisis de PCR de muestras de sangre recolectadas al nacer, 6 semanas, 3 y 6 meses de edad y según las siguientes definiciones adaptadas de Bryson y colegas [5]. Brevemente, los bebés con ADN PCR positivo al nacer fueron infectados IU. Los bebés con PCR negativo resultado de la muestra obtenida al nacer pero que se hicieron positivos por 6 semanas de edad fueron infectados IP. Los lactantes con resultados negativos de PCR al nacer y 6 semanas de edad pero que posteriormente se convirtieron en DNA PCR positivo fueron considerados infectados durante el período PP. En el análisis de comparación de los 3 modos diferentes de TCM, 12 bebés infectados por el VIH-1 fueron excluidos porque los resultados de PCR no estaban disponibles a las 6 semanas de edad. Métodos completos de reclutamiento, recolección de características basales, procedimientos de laboratorio La variación de la secuencia de nucleótidos de todo el promotor, codificación y parte de las 39 regiones UTR del gen DC-SIGNR en la población del estudio se determinó previamente [7]. La reconstrucción del haplotipo se realizó utilizando el método estadístico Bayesiano implementado en FASE [8], versión 2.1.1, utilizando polimorfismo nucleótido único (SNP) con una frecuencia mínima de alelos (MAF) del 2%. Aplicamos el algoritmo cinco veces, utilizando diferentes semillas generadas aleatoriamente, y se obtuvieron resultados consistentes a lo largo de las carreras (Figura 1 ). Quince SNPs con etiqueta de haplotipo (htSNPs) fueron identificados por el software HaploBlockFinder [9] con un MAF $5%. Estos htSNPs fueron genotipados en los 197 infantes mediante el análisis de secuenciación PCR directo como hemos descrito El genotipo de región de repetición DC-SIGNR 4 fue determinado por amplificación PCR seguida de migración en geles de agarosa del 1,5% [10]. Se analizaron secuencias de ADN en la región promotora con la interfaz TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) para sitios de unión de factores de transcripción putativos utilizando la base de datos TRANSFAC. Se realizaron ensayos de reporteros Luciferase utilizando vector pGL2-Básico para investigar el efecto funcional de mutaciones en la actividad promotora DC-SIGNR. El ADN genómico de los sujetos homocigotos para las variantes promotoras y WT fue amplificado desde la posición nucleótida 2715 a 21 y clonado entre los sitios de clonación múltiple BglII y HindIII en el vector pGL2-Basico que alberga un gen luciferasa de luciferasa de reportero aguas abajo (Invitrogen Canada inc, Burlington, Canadá). Todos los clones recombinantes fueron verificados por secuenciación de ADN. El vector reportero de prueba de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciferasa de fuego fue co-transfectado a una proporción de 10:1 con el expresor constitutivo de Renilla luciferasa, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cultivamos células Las células se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa utilizando 20 mg de extracto proteico según el fabricante (Promega) a 44 h de post-transfección. La actividad luciferasa de Firefly se normalizó a la actividad de Renilla luciferasa. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como un control positivo en estos experimentos. Realizamos ensayos de lucierasa por triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como error estándar medio 6 (S.E.M.). Los tejidos placentarios de primer término se obtuvieron a partir de abortos tras la interrupción voluntaria del embarazo en CHUM Hôpital Saint-Luc (Montreal, Canadá). Se utilizaron tejidos de 3 H1 (asociados con TCM del VIH-1) y 3 H15 (tipo salvaje) haplotipos homocigotos para analizar posibles diferencias en la expresión isoforma. Los ARN placentarios totales fueron extraídos por MasterPure DNA y ARN Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) según el fabricante. Fragmentos correspondientes a la región de codificación DC-SIGNR fueron transcritos (RT) invertidas y luego amplificados por PCR anidados con los siguientes imprimadores; RT imprimadores RR, primer PCR RF y RR y segundo PCR RcF y RcR según Liu y colegas [11]. 1 mg de ARN total fue transcrito con Expand RT (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.) según el fabricante y fue amplificado con PCR de ADN Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Los principales productos de PCR de la segunda reacción PCR fueron extraídos en gel con el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canadá) y clonados utilizando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciación (Invitrogen). Para cada placenta, 15 clones diferentes fueron seleccionados aleatoriamente y amplificados con imprimadores M13 y secuenciados con secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 capilar (Applicated Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias fueron analizadas y alineadas con secuencia de referencia GeneBank NM La expresión cuantitativa de las isoformas DC-SIGNR 1,5 mg de ARN placentario fue transcrita inversamente utilizando 2,5 mM de Oligo dT 20 y Expand RT en 20 ml de volumen según el fabricante (Roche Applied Science). 15 ng de cDNA total en un volumen final de 20 ml se utilizó para realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) en un Rotor Gene Realtime Rotary Analyser (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Se utilizaron muestras de 2 sujetos en cada grupo porque la calidad ARN de otros no era adecuada para un análisis QRT-PCR. La amplificación de todas las isoformas DC-SIGNR se realizó utilizando un par de primos específico exon 5 (Tabla S1 ). Las isoformas ligadas a la membrana se amplificaron utilizando imprimaciones específicas para el exón 3, correspondientes al dominio transmembrana común de DC-SIGNR. Las primeras fueron dirigidas a la unión exon-exón y los extractos de ARN fueron tratados con Dnasa (Fermantas International inc, Burlington, ON, Canadá) para evitar la amplificación del ADN contaminante. Las curvas estándar (50-500 000 copias por reacción) fueron generadas mediante dilución en serie de un DC-SIGNR de larga duración o ADN de plasma GAPDH comercial (Invitrogen). Todas las reacciones de qPCR tuvieron eficiencias que oscilaban entre el 99% y el 100%, incluso en presencia de 20 ng de ácidos nucleicos no específicos, y por lo tanto se pudo comparar. El número de copias de muestras desconocidas se estimó colocando el número de ciclo de PCR medido (u Para corregir las diferencias en calidad de ARN y cantidad entre muestras, los niveles de expresión de las transcripciones fueron normalizados a las transcripciones genéticas GAPDH de referencia. Las secuencias de primos GAPDH fueron amablemente proporcionadas por A. Mes-Masson en el CHUM. Los resultados se presentan como número de copia génica objetivo por 10 5 copias de GAPDH. La relación de isoformas ligadas a membranas fue calculada como E3/E5. Las isoformas solubles fueron calculadas restando unión de membranas de isoformas totales. Realizamos ensayos de QPCR en triplicado en tres experimentos independientes. Los resultados se expresan como media6S.E.M. El análisis estadístico se realizó utilizando el GraphPad PRISM 5.0 para Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, EE.UU.). Se compararon diferencias en las características basales y frecuencias genotípicas de haplotipos o htSNPs entre los grupos utilizando el análisis x 2 o la prueba exacta de Fisher, se utilizó el análisis de regresión logística para estimar las odds ratios (OR) para cada genotipo y factores de riesgo basales, se utilizó regresión logística múltiple para definir predictores independientes identificados como significativos en el análisis bruto, se calcularon las OR y el intervalo de confianza del 95% con el método exacto, se evaluaron comparaciones de variables continuas entre grupos con la t de Student no pareada cuando las variables se distribuían normalmente y con la U de Mann-Whitney cuando lo contrario, se consideraron significativas en P0,05. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las madres que participaron en el estudio y el ensayo de ZVITAMBO, y la investigación reportada en este trabajo fue aprobada por The We realizó un estudio de asociación de polimorfismo DC-SIGNR en 197 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 no tratadas reclutados en Harare, Zimbabwe. De ellos, 97 niños fueron infectados con VIH-1 y 100 niños permanecieron sin infección. De los 97 niños infectados con VIH-1, 57 fueron infectados con IU, 11 con IP infectada y 17 infectados con PP. No se determinó el momento de la infección para 12 niños infectados con VIH-1. Las características basales de las madres y lactantes se presentan en la Tabla 1. La edad materna y el recuento de células CD4, el sexo infantil, el modo de parto, la duración de la ruptura de membrana y la edad gestacional fueron similares entre todos los grupos. Sin embargo, la carga viral materna 29 000 copias/ml se asoció con un aumento del riesgo tanto en UI como en PP con odds ratios (OR) de 3,64 (IC 95% = 1,82-7,31, P = 0,0002) y 4,45 (IC 95% = 1,50-13,2, P = 0,0045) para la transmisión del VIH-1, respectivamente. En nuestras muestras de estudio (Tablas S2 y S3 ) se identificaron 15 SNPs marcados con haplotipos (htSNPs) correspondientes a los 15 haplotipos principales de DC-SIGNR (Figura 1 ). H1 (31%) y H3 (11%) fueron los haplotipos más frecuentes observados (Figura 1 ) siendo homocigosos para el haplotipo H1 se asociaron con un aumento del riesgo de ambas UI (OR: 4, Los bebés que albergaban dos combinaciones de copias de haplotipos H1 y/ o H3 (H1-H1, H1-H3 o H3-H3) tenían un mayor riesgo de IU (OR: 3,42, P = 0,007) e IP (OR: 5,71, P = 0,025) pero no de infección por VIH-1 (P = 0,098) en comparación con los no portadores infantiles (Tabla 2 ). Estas últimas asociaciones siguieron siendo significativas tras el ajuste de la carga viral materna para ambas UI (OR: 3,57, IC 95% = 1,30-9,82, P = 0,013) e IP (OR: 5,71, IC 95% = 1,40-23, P = 0,025) transmisión del VIH-1. Los haplotipos H1 y H3 comparten un grupo de mutaciones (p-198A, int2-391C, int2-180A, ex4 De estos, las variantes p-198A e int2-180A se asociaron significativamente con la TCM del VIH-1 (Tabla S2 ). En el análisis de regresión no ajustado, los lactantes homocigotos para las variantes p-198A e int2-180A presentaron un aumento del riesgo de UI (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, respectivamente) e IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, respectivamente) infección por VIH-1 en comparación con los lactantes o no portadores de heterocigoto (Tabla 3). Cuando se realizó ajuste por factores maternos, sólo la asociación con la variante int2-180A siguió siendo significativa para la transmisión por IU (OR: 3,83, IC 95% = 1,42-10, 4, P = 0,008) e IP Así, los bebés homocigotos para la variante DC-SIGNR int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 tuvieron 4 a 6 veces más probabilidades de ser infectados por el VIH-1 durante el embarazo o durante el parto, respectivamente. La empalme alternativa del gen DC-SIGNR en la placenta produce ambos repertorios isoformados unidos a membrana y solubles [3]. La proporción relativa de DC-SIGNR unido a membrana y soluble podría influir de manera plausible en la susceptibilidad a la infección VIH-1 [11]. Por lo tanto, hicimos una hipótesis de que las mutaciones DC-SIGNR asociadas con la TCM del VIH-1 tendrían un impacto tanto en el nivel de expresión DC-SIGNR y en el repertorio isoforma producido. Se clonó DC-SIGNR a partir de tejidos placentarios mediante RT-PCR a partir de 3 muestras H1 homocigotas que contenían tanto las variantes DC-SIGNR p-198AA e int2-180AA asociadas a la transmisión del VIH-1 y 3 muestras de tipo salvaje homocigoto (WT) (p-198CC, int2-180GG). Se seleccionaron quince clones por muestra al azar para su secuenciación. Como era de esperar, se encontró un amplio repertorio de transcripciones DC-SIGNR en todas las muestras con 9 a 16 isoformas diferentes por individuo. Se identificaron un total de 65 transcripciones distintas (Figura S1), de las cuales 3 eran transcripciones de duración completa. 64 de los clones secuenciados contenían un total de 69 sustituciones de aminoácidos con 3 nuevos C terminos y 2 codones de parada Sin embargo, la diversidad se atribuyó principalmente a la eliminación total del exón 2 o exón 3 o a variaciones en la longitud de la región del cuello (exón 4) del DC-SIGNR. La eliminación del exón 3 elimina el dominio transmembrana de la proteína y conduce a la expresión de isoformas solubles del DC-SIGNR [3]. Curiosamente, la abundancia de isoformas ligadas a la membrana en los tejidos placentarios de los homocigotos H1 parece ser menor que la observada en muestras de individuos de WT (Figura S1 ). La eliminación del exón 3 fue confirmada por la secuenciación e hipotetizamos que el salto de exón 3 podría deberse a la presencia de la mutación int2-180A observada en lactantes con el haplotipo H1. De hecho, esta mutación intron se encuentra 180 pb aguas abajo del exón 3 y potencialmente modifica los eventos de empalme (Figura 2A ). Confirmamos que la variación en las proporciones de transcripción observadas entre los dos grupos también se reflejó en el nivel de expresión del ARNm en la placenta. Para cuantificar las isoformas unidos a la membrana frente a las isoformas solubles en muestras placentarias de bebés homocigosos H1 y WT, amplificamos la secuencia del exón 5 (E5) presente en todas las isoformas DC-SIGNR (transcripciones totales). Luego amplificamos el exón 3 (E3) que se elimina en las formas solubles y luego calculamos la relación E3:E5. Se encontró que los tejidos placentarios de los lactantes homocigosos H1 expresan una proporción significativamente menor de DC-SIGNR unido a la membrana (18%) en comparación con los de los individuos WT (36%) (P = 0,004) (Figura 2B ) sugiriendo que el salto de exón 3 ocurre con mayor frecuencia en presencia de la variante DC-SIGNR int2-180A asociada con el TCM del VIH-1. La variante DC-SIGNR int2-180A siempre se transmite con la mutación promotora p-198A (Figura 1 ). En el análisis de regresión no ajustado, la variante p-198A se asoció significativamente con UI pero no con la transmisión IP y PP VIH-1 (Tabla 3). El análisis del sitio de unión del factor de transcripción computacional predice Tabla 1. Figura 3A ). La actividad luciferasa del constructo variante p-198A fue significativamente menor que la del constructo promotor de WT p-198C (p-198C/A ratio = 2, P = 0,006) (Figura 3B ) sugiriendo que DC-SIGNR p-198A afecta a la actividad promotora. Los otros mutantes promotores (p-577C y p-323A) observados en la población zimbabuense no afectaron a la transcripción DC-SIGNR en este ensayo (Figura S2). Para determinar el impacto neto de la mutación DC-SIGNR p-198A sobre la expresión DC-SIGNR en la placenta, cuantificamos el número absoluto de transcripciones DC-SIGNR totales y de unión de membrana en las muestras homocigoto H1 y placentales de tipo salvaje El número total de transcripciones DC-SIGNR se determinó en 6856213 (copias DC-SIGNR6S.E.M por 10 5 copias GAPDH) en las muestras placentarias de lactantes homocigóticos H1 y fue 4 veces menor en comparación con la encontrada en las placentas de individuos WT (27816638, P = 0.011) (Figura 3C ). Como se sugirió anteriormente, la mutación int2-180A podría inducir el salto de exón 3 dando lugar a una menor producción de DC-SIGNR unido a membrana. Aunque la disminución en el número total de transcripciones DC-SIGNR en muestras placentarias homocigóticas H1 que contenían tanto las variantes p-198AA como int2-180AA afectó la proporción de isoformas solubles y ligadas a la membrana, el efecto de estas mutaciones fue más pronunciado en las isoformas ligadas a la membrana con una disminución de 8 veces (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6; P = 0,003) en comparación con una disminución de 3 veces en las isoformas solubles totales (H1 = 5686181,9 vs WT = 19256495,3; P = 0,03) (Figura 3C). Por lo tanto, las mutaciones DC-SIGNR p-198A e int2-180A asociadas con la TCM del VIH-1 disminuyeron significativamente el nivel Tabla 3. Asociaciones entre el promotor de DC-SIGNR infantil p-198 e intron 2 (int2)-180 variantes e intrauterina (UI), intraparto (IP) y postparto (PP) transmisión del VIH-1 de madre a hijo. Nuestros resultados genéticos, apoyados por el ensayo de expresión en placenta, sugieren la implicación de DC-SIGNR en el TCM del VIH-1. La homocigosidad para el haplotipo H1 se asoció con la transmisión de UI en el análisis de regresión no ajustada. Sin embargo, la asociación desapareció después del ajuste para los factores maternos presumiblemente debido al pequeño número de bebés homocigotos H1 analizados en cada grupo. H1 y H3 fueron los haplotipos más frecuentes observados en la población del estudio y comparten un grupo de mutaciones (Figura 1 ). La agrupación de haplotipos H1 y H3 aumentó el poder del estudio y permitió la identificación de mutaciones DC-SIGNR específicas asociadas con la TCM del VIH-1. De hecho, dos mutaciones compartidas por los haplotipos H1 y H3 se asociaron con la transmisión vertical del VIH-1. La int2-180A se asoció con un aumento de 4 veces en el riesgo de UI y 6 veces en el riesgo de IP después del ajuste por los factores maternos. Aunque la variante p-198A se asoció con la transmisión UI, la asociación desapareció después del ajuste por la carga viral materna. Sin embargo, se demostró que esta mutación reduce la actividad transcripcional DC-SIGNR in vitro y produce un menor nivel de transcripciones DC-SIGNR en tejidos placentarios en combinación con la variante int2-180A. Dado que int2-180A siempre se transmite con p-198A en los haplotipos combinados asociados a la ETMT H1/H3, mientras que p-198A se lleva a cabo en otros haplotipos no asociados (Figura 1), podemos especular que la mutación p-198A sola puede tener un efecto menor in vivo, mientras que en combinación con la variante int2-180A, ambos actúan para reducir el nivel de expresión DC-SIGNR placentaria que resulta en un aumento del riesgo de ETM de VIH-1. La mayoría de la transmisión de UI ocurre durante el último trimestre del embarazo (revisado en [12] ). Las muestras de placenta a término completo no estaban disponibles para el estudio actual y los ensayos de expresión se realizaron en tejidos placentales de primer plazo. Un estudio previo que analizó el repertorio de isoformas placentarias DC-SIGNR en muestras de placenta a término demostró una diversidad similar de transcripciones DC-SIGNR como en los tejidos placentarios de primer término estudiados en este estudio [3]. Sin embargo, dado que los niveles de expresión DC-SIGNR nunca se han comparado entre los diferentes términos del embarazo, no se sabe si la expresión DC-SIGNR varía durante el embarazo. Sin embargo, es razonable suponer que las diferencias interindividuales tanto en el repertorio isoformo de DC-SIGNR como en los niveles de transcripción observados entre los bebés homocigóticos H1 y WT se reflejarían a lo largo del embarazo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han centrado en el papel potencial de DC-SIGNR en la infección trans del VIH-1 in vitro [2, 10]. Sin embargo, los múltiples mecanismos involucrados en la infección trans y redundancia entre las funciones de la lectina de tipo C dificultan la determinación de la participación real de DC-SIGNR en este modo de infección in vivo [13, 14]. La fuerte correlación que observamos entre la transmisión vertical del VIH-1 y las variantes genéticas de DC-SIGNR que producen bajos niveles de DC-SIGNR en la placenta sugiere que mecanismos distintos de la infección trans mediada por DC-SIGNR podrían operar durante la transmisión vertical del VIH-1. Por ejemplo, DC-SIGNR también ha demostrado funcionar como receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor receptor [15]. Chan y sus colegas demostraron recientemente que las células CHO transfectadas por DC-SIGNR disminuyen los títulos de SARS-CoV mediante una mayor captura y degradación del virus de manera dependiente del proteasoma [4]. Dado que las células endoteliales expresan MHC-I y II, los antígenos virales degradados podrían presentarse a las células inmunes para provocar una respuesta inmune adaptativa [16, 17]. El receptor de núcleo HIV-1 CCR5, pero no CD4, se coexpresa con DC-SIGNR en las células endoteliales placentarias y de barrera hematoencefálica (BBB) [18, 19]. La unión del VIH-1 gp120 al receptor CCR5 en las células endoteliales compromete la integridad del BBB y aumenta la adhesión y transmigración de los monocitos a través del BBB [20, 21]. Por lo tanto, es posible que una menor expresión de DC-SIGNR, en particular las isoformas ligadas a la membrana, en las células endoteliales capilares placentarias pueda favorecer la unión del VIH-1 al receptor CCR5, en lugar del receptor DC-SIGNR, facilitando la migración de las células maternas infectadas por el VIH-1 a través de la barrera placentaria que resulta en la transmisión UI del VIH-1. La variante int2-180A contenida en los haplotipos H1 y H3 se asoció con la transmisión IP, lo que sugiere que DC-SIGNR también afecta a la transmisión del VIH-1 durante el parto. El paso por el canal del parto podría exponer potencialmente a los bebés a través de una entrada en el portal de la mucosa (presumiblemente oftalmológica, cutánea o gastrointestinal), mientras que el insulto placentario durante el parto (físico o inflamatorio) puede mejorar el paso transplacental de las células maternas infectadas por el VIH-1 a la circulación fetal [22, 23]. Este proceso llamado microtransfusión se ha propuesto con respecto a los resultados obtenidos en una cohorte malauiana. Kweik y sus colegas encontraron una asociación significativa entre los niveles de ADN materno en la sangre del cordón umbilical y la transmisión IP del VIH-1, lo que sugiere que es probable que el paso de células maternas infectadas a través de la placenta ocurra durante el parto [22]. Así, de manera similar a lo sugerido anteriormente para la transmisión de la IU, el nivel relativamente inferior de DC-SIGNR en la placenta de los bebés homocigotos que albergan la variante int2-180A podría promover la unión del VIH-1 al receptor CCR5 en las células endoteliales que afectan la integridad de la barrera placentaria y facilitan el paso de las células maternas infectadas en la circulación fetal durante el parto. Además de DC-SIGNR, se sabe que otros receptores del VIH-1 influyen en la TCM del VIH-1 (revisado en [24] ). Se ha demostrado que las variantes genéticas de la CCR5 influyen en la transmisión vertical del VIH-1. Las variantes promotoras de la CCR5 que resultan en una mayor expresión del receptor se asocian con un mayor riesgo de TCM del VIH-1 entre los africanos subsaharianos [25, 26]. El polimorfismo de eliminación de 32 pb en la CCR5 se ha demostrado que protege de la transmisión vertical del VIH-1 [27], pero esta variante está prácticamente ausente entre las poblaciones africanas [28]. El elevado número de copias de CCL3L1, un potente ligando supresor del VIH-1 para la CCR5, está asociado con una mayor producción de quimioquinas y un menor riesgo de TCM del VIH-1 entre los lactantes sudafricanos [29, 30]. La lectina de unión a la manosa (MBL) es un receptor inmune innato sintetizado en el hígado y segregado en el torrente sanguíneo en respuesta a la señal de inflamación. MBL promueve la eliminación de patógenos por opsonización y fagocitosis, y la expresión reducida de MBL resultante de polimorfismo en regiones codificantes y no codificantes se ha asociado con un aumento del riesgo de TCM del VIH En este estudio, demostramos por primera vez, el impacto funcional potencial de las mutaciones DC-SIGNR en su expresión en la placenta y en la transmisión vertical del VIH-1. Creemos que la presencia de DC-SIGNR en la superficie celular endotelial placentaria puede proteger a los bebés de la infección por el VIH-1 capturando virus y promoviendo su degradación/presentación. Sin embargo, en la placenta que contiene bajos niveles de DC-SIGNR, el VIH-1 se une preferentemente al CCR5 en células endotelial, lo que resulta en una pérdida de integridad de la barrera placentaria y un mayor paso de las células maternas infectadas por el VIH-1 en la circulación fetal que conduce al TCM del VIH-1. Este mecanismo también puede aplicarse a otros patógenos transmitidos verticalmente conocidos por interactuar con DC-SIGNR como el VIH-2, hepatitis C y virus del dengue y Las asociaciones entre los genotipos de región repetida de DC-SIGNR infantil exon 4 y la transmisión del VIH-1 de madre a hijo.CI, Intervalo de confianza; N, número; NA; no aplicable; OR, odds ratio a P-value según lo determinado por la prueba Chi-cuadrado. b Comparación entre el genotipo y todos los demás. Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Figura S1 DC-SIGNR transcripciones repertorio en placenta. Los principales productos RT-PCR a partir del extracto de ARN de 3 muestras homocigóticas H1 y 3 homocigóticas WT placenta fueron purificadas, clonadas y secuenciadas. Se analizaron las secuencias según la secuencia de referencia NCBI NM_014257. TC; cola citoplasmática, TM; dominio transmembrana; WT; tipo salvaje Se encontró en: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Figura S2 Efecto de la variante promotora DC-SIGNR sobre la actividad transcripcional en el ensayo de reporter de luciferasa in vitro en células transfectadas HeLa. Expresión relativa de luciferasa de pGL2-Basico, vector parental sin promotor. Expresión Constructos de promotor DC-SIGNR, variante p-577C o variante p-323A se calcularon relativamente a este valor. Los datos se presentan en valores medios6S.E.M de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para comparar la expresión relativa de luciferasa de los receptores de variantes p-557C y p-323A contra el constructo de tipo salvaje (WT) se utilizó la prueba ANOVA de ida seguida de la prueba Dunnett para la comparación múltiple. El vector CMV-Tat de 0 mg, 0,5 mg o 1 mg se transfectó con LTR-Luc como control positivo en estos experimentos.
|
¿Cómo puede reducirse el efecto de CCR5 en la transmisión del VIH-1?
| false
| 321
|
{
"text": [
"The 32-pb deletion polymorphism in CCR5 has be shown to protect from vertical transmission of HIV-1"
],
"answer_start": [
27966
]
}
|
Se ha demostrado que el polimorfismo de eliminación de 32 pb en CCR5 protege de la transmisión vertical del VIH-1
|
650
|
El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.
|
¿Qué es IFITM?
| false
| 568
|
{
"text": [
"interferon-induced transmembrane"
],
"answer_start": [
353
]
}
|
transmembrana inducida por interferón
|
650
|
El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.
|
¿Cuántos residuos de cisteína están contenidos en el primer dominio transmembrana de IFITM3?
| false
| 569
|
{
"text": [
"three"
],
"answer_start": [
701
]
}
|
tres
|
650
|
El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.
|
¿Qué inhibe la palmitoilación S?
| false
| 570
|
{
"text": [
"2-bromopalmitic acid (2BP)"
],
"answer_start": [
1509
]
}
|
Ácido 2-bromopalmítico (2BP)
|
650
|
El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.
|
¿Qué interacción es inhibida por la presencia de ácido 2-bromopalmítico (2BP)?
| false
| 571
|
{
"text": [
"IFITM5 with FKBP11"
],
"answer_start": [
1807
]
}
|
IFITM5 con FKBP11
|
650
|
El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.
|
¿Qué es una función asociada con IFITM5?
| false
| 572
|
{
"text": [
"bone formation factor."
],
"answer_start": [
2195
]
}
|
factor de formación ósea.
|
650
|
El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.
|
¿Qué regula la actividad antiviral de IFITM3?
| false
| 573
|
{
"text": [
"S-palmitoylation on the protein"
],
"answer_start": [
3574
]
}
|
S-palmitoilación en la proteína
|
650
|
El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.
|
¿Cuál es otro nombre para IFITM5?
| false
| 574
|
{
"text": [
"bonerestricted IFITM-like (BRIL) protein"
],
"answer_start": [
6107
]
}
|
Proteína similar a IFITM (BRIL) restringida por el hueso
|
650
|
El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.
|
¿Por qué los interferones no promueven la expresión de IFITM5?
| false
| 575
|
{
"text": [
"the region upstream of the ifitm5 gene lacks the interferon regulatory elements"
],
"answer_start": [
6335
]
}
|
la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón
|
650
|
El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.
|
¿Cuál es la similitud de aminoácidos entre IFITM5 y las otras proteínas IFITM?
| false
| 576
|
{
"text": [
"~ 65% similarity"
],
"answer_start": [
6693
]
}
|
~ 65% de similitud
|
650
|
El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.
|
¿Cuál es la similitud de aminoácidos entre IFITM 1, IFITM 2 e IFITM 3?
| false
| 577
|
{
"text": [
"~ 85% similarity"
],
"answer_start": [
6742
]
}
|
~ 85% de similitud
|
650
|
El papel de la S-Palmitoylation en IFITM5 para la interacción con FKBP11 en células de Osteoblastohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831Licencia:cc-byAbstract: Recientemente, una de las proteínas familiares de la transmembrana inducida por interferón, IFITM3, se ha convertido en un objetivo importante para la actividad contra la infección por el virus de la gripe A (H1N1). En esta proteína, una modificación post-translacional por ácidos grasos covalentemente unidos a la cisteína, llamada S-palmitoilación, juega un papel crucial para la actividad antiviral. IFITM3 posee tres residuos de cisteína para la S-palmitoilación en el primer dominio de la transmembrana (TM1) y en el bucle citoplasmático (CP). Debido a que estas cisteínas están bien conservadas en las proteínas de la familia de mamíferos IFITM, la S-palmitoilación en estas cisteínas es significativa para sus funciones. IFITM5 es otra proteína de la familia IFITM e interactúa con la proteína de unión FK506 (FKBP11) para formar un complejo de mayor orden en células osteoblastales, que induce la expresión de genes inmunológicamente relevantes. En este estudio, investigamos el papel que desempeña la palmitoilación S de IFITM5 en su interacción con FKBP11 en las células, ya que esta interacción es un proceso clave para la expresión génica. Nuestras investigaciones con un reportero establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA), y un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP), revelaron que IFITM5 fue palmitoilado S además de IFITM3. Específicamente, encontramos que los residuos de cisteína en el dominio TM1 y en el bucle CP fueron palmitoilados S en IFITM5. Luego, revelamos por inmunoprecipitación y análisis de manchas occidentales que la interacción de IFITM5 con FKBP11 fue inhibida en presencia de 2BP. El mutante que carecía del sitio S-palmitoylation en el dominio TM1 perdió la interacción con FKBP11. Estos resultados indican que la S-palmitoylation en IFITM5 promueve la interacción con FKBP11. Finalmente, investigamos la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas en presencia de 2BP, ya que IFITM5 fue identificado originalmente como factor de formación ósea. El experimento resultó en una aberración morfológica del nódulo óseo, lo que también indicó que la S-palmitoylation contribuye a la formación ósea. Texto: La familia de proteínas transmembranas inducidas por interferón (IFITM) (también conocida como la familia Fragilis en ratones) es parte de la familia de las dispaninas [1] y está compuesta por α-hélices de doble transmembrana conectados por un bucle citoplasmático (CP) y secuencias de polipéptidos amino- y carboxil-terminales (Figura 1-A) extracelulares (EC). Las proteínas IFITM se conservan evolutivamente en vertebrados [2]. Investigaciones genómicas recientes han revelado que hay 5 miembros IFITM en humanos (IFITM1, 2, 3, 5 y 10) y 7 miembros en ratones (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7, y 10). Estas proteínas desempeñan papeles en diversos procesos biológicos, como la maduración de células germinativas durante la gastrulación (IFITTM1-3) [3] [5] [5], la adhesión de células a células (IFITTM1) [6] [7] [8], la actividad antiviral (IFITTM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17], y la formación ósea (IFITTM5] [18] [19] [20] [21] [22], aunque actualmente se desconocen las funciones detalladas de IFITM6, 7 y 10; en particular, IFITM3 ha sido objeto de estudios intensivos sobre su actividad contra la infección e internalización del virus de la gripe A (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14]. En 2010, el Dr. Yount y sus colaboradores informaron que la actividad antiviral de IFITM3 depende de la palmitoilación S en la proteína [10]. La palmitoilación S [23] es una modificación post-translacional de las proteínas por los ácidos grasos saturados C 16 (ácidos palmíticos) covalentemente unidos a ciertos residuos de cisteína a través de un enlace tioéster (Figura 1-B). La modificación es catalizada reversiblemente por las proteínas aciltransferasas y las tioesterasas acilproteínas, y confiere propiedades únicas a la proteína, tales como unión a la membrana y segmentación, inmunoreactividad, alineación de secuencias aminoácidos de IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3 derivadas de ratones. Los residuos conservados se destacan en negro. Las tres cisteinas conservadas se resaltan en rojo y numeradas en base a la secuencia de IFITM5 (top) e IFITM3 (bottom). Los residuos únicos en IFITM5 se resaltan en gris. Los dominios transmembrana primero y segundo, las secuencias extracelulares y el bucle citoplásmico se indican por flechas y se denotan como TM1 y TM2, EC y el bucle CP, respectivamente. Los dominios TM fueron predichos por SOSUI. Los aspartatos en la región C-terminal en IFITM5 se muestran en azul. B) La ilustración esquemática de la proteína S-palmitoilación. El ácido C 16-palmítico se une a la cisteína a través de un enlace tioéster. La palmitoilación y la despalmitoilación son catalizadas por proteínas aciltransferasas y acilproteínas tioesterasas, respectivamente. En este estudio se resume la hidroxilamina, NH 2 OH, para reducir la vinculación tioestérmica. C) La identidad de la secuencia de aminoácidos (similaridad) entre IFITM5, IFITM1, IFITM2 e IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 y la interacción proteína-proteína. Los autores revelaron que IFITM3 es S-palmitoilado en tres quisteinas proximales de membrana, Cys71 y Cys72 en el primer dominio transmembrana (TM1), y Cys105 en el bucle CP (Figura 1-A) [10]. Además, IFITM3 carece de la palmitoilación S no se agrupa en la membrana celular y disminuye significativamente la actividad antiviral. Además, las cisteinas en IFITM2, Cys70, Cys71 y Cys104 también son palmitoiladas de la misma manera, lo que afecta a la localización intracelular [24]. Un estudio resentido ha revelado que la murina IFITM1 tiene cuatro residuos de cisteína (Cys49, Cys50, Cys83 y Cys103) para la palmitoilación S, que es necesaria para la actividad antiviral y la estabilidad proteica [25]. Los otros miembros de la familia IFITM también poseen estas cisteínas (Figura 1-A), y por lo tanto el papel de la espalmitoilación en las cisteinas debe ser significativo para las funciones de las proteínas IFITM. Aquí, nos centramos en las proteínas de la familia IFITM5, que también se conoce como proteína similar a IFITM (BRIL) [18]. Entre las proteínas de la familia IFITM, IFITM5 es única. (i) Expresión de IFITM5: A diferencia de las otras proteínas de la familia IFITM, la expresión de IFITM5 no es inducida por interferones porque la región anterior al gen ifitm5 carece de los elementos reguladores del interferón [26]. Además, la expresión de IFITM5 se limita principalmente a las células osteoblastadas [18, 19, 27], mientras que las otras proteínas de IFITM se expresan ubicuamente (ii). Además, IFITM5 tiene un dominio rico en aspartato en la región C-terminal, que podría estar involucrado en la unión al calcio (Figura 1 -A) [26]. iii) Papel de IFITM5 en la formación ósea: La expresión de IFITM5 está asociada con la mineralización durante el proceso de formación ósea en células osteoblásticas [18] [19] [20] [20]. Estudios anteriores han confirmado la expresión de IFITM5 en tejidos óseos en ratones, ratas, humanos y tammar wallabies [2]. Los ratones ifitm5-gene knockout tienen huesos más pequeños [19]. Además, el derribo del gen ifitm5 por el ARN de la horquilla pequeña induce una disminución en la formación de nódulos óseos, mientras que la sobreexpresión del gen en células UMR106 ha demostrado iv) Papel del IFITM5 en la actividad inmunitaria: Estudios recientes han revelado que el IFITM5 interactúa con la proteína 11 de unión FK506 (FKBP11) para formar IFITM5-FKBP11-CD81-el complejo regulador negativo del receptor de la prostaglandina F2 (FPRP) [28]. Cuando se forma el complejo, se inducen las expresiones de 5 genes inducidos por interferón, incluyendo el antígeno 2 de células estromales de médula ósea (Bst2), la proteína 1 inducible del interferón (Irgm), la proteína inducida por interferón con tetratricopéptido repite 3 (Ifit3), b(2) microglobulina (B2m) y el gen antígeno de clase I del MHC. En consecuencia, estos resultados indican que el IFITM5 está involucrado no sólo en la formación ósea sino también en la actividad En este estudio se investigó la palmitoilación S de IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11 en células de osteoblasto de ratón. Las células transfectadas por un plásmido DNA que codificaba el ratón IFITM5 fueron cultivadas en presencia de un reportero químico establecido, ácido 17-octadecinoico (17-ODYA) [29, 30], o un inhibidor para la palmitoilación S, ácido 2-bromopalmítico (2BP) [31]. Los ensayos bioquímicos usando estos compuestos revelaron que el tipo salvaje IFITM5 es S-palmitoilado. Para identificar el sitio de Spalmitoilación en IFITM5, se prepararon mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C86A, -C52A/C53A, y -C52A/53A El ensayo de reportero químico sugirió que al menos dos de las tres cisteínas en IFITM5 son S-palmitoiladas. La interacción de IFITM5 con FKBP11 fue examinada por inmunoprecipitación, resultando en la pérdida de la interacción en presencia de 2BP. El mismo resultado se obtuvo en los dos mutantes, C52A/C53A y Cys-less. Estos resultados sugieren que la S-palmitoilación en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de IFITM5 es necesaria para la interacción con FKBP11. Por otro lado, Cys86 en el bucle CP de IFITM5 fue S-palmitoilada pero no involucrada en la interacción. Debido a que esta interacción es importante para la expresión génica inmunológicamente relevante, se indicó que el papel de la palmitoilación S es promover la interacción de IFITM5 con FKBP11 y regular la actividad inmunitaria en las células osteoblásticas. Se discutirá el posible mecanismo de interacción y el efecto de la palmitoilación S en la formación de nódulos óseos. Para la expresión celular mamífera, se construyeron vectores de plásmidos de tipo salvaje IFITM5 (IFITM5-WT) y FKBP11 fusionado con FLAG (FKBP11-FLAG) insertando los genes clonados en un vector de expresión neopBApo-CMV (Takara Bio, Shiga, Japón). Los detalles de las construcciones de ADN recombinante fueron los mismos descritos anteriormente [19]. Los genes de los mutantes IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) se prepararon utilizando un kit QuikChange de mutagenesis dirigido por el sitio (Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores plásmidos de los IFITM5-WT fusionados con FLAG, -C52A/53A y Cys-less se construyeron insertando los genes clonados en el vector de expresión neo de pBApo-CMV. Para la expresión celular de E. coli, el vector plásmido de IFITM5-WT se construyó insertando el gen clonado en un vector de expresión pET22b (Novagen, Madison, WI). El primer delantero 5'-GGAATTCATTCATATTACACTTCATATCCCGTG-3' y el primer reverso 5'-CCGCTCGAGTTATAGTCTCATCAAACTTG-3' fueron utilizados para amplificar el gen que codifica todo el IFITM5 del vector plásmido para la expresión celular mamífera descrita anteriormente. Las letras subrayadas denotan un NdeI y un sitio de escote XhoI, respectivamente. Los plásmidos de mutantes IFITM5 fueron preparados usando un kit de mutagenesis dirigido por el sitio QuikChange. El sentido y los imprimadores antisenso utilizados fueron 5'-GGCAGTATGCTCCAAAGCCAAGGCGTACCATCTGGGCTGC-3' y 5'-GCAGCCGAGATGGTGGTGCCTGCTGGTGGTGGGGAGCATACT GCC-3' para IFITM5-C86A; y 5'-GCACGATGTACCTGAATGCGCGGCGCTTGGTGCTG CGC-3' y 5'-GCGCCAGGAATGAGCGCGCCGCGACAGAGCATCG TGC-3' para IFITM5-C52A/C53A, respectivamente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células MC3T3 similares a los osteoblastos fueron provistas por el RIKEN, Cell Bank (RCB 1126). Los procedimientos de cultivo celular, transfección y expresión proteica fueron los mismos reportados anteriormente. Cuando fue necesario, el ácido 2-bromopalmítico (2BP; Wako, Osaka, Japón) y el ácido 17-octadecinoico (17-ODYA; Sigma-Aldrich) fueron disueltos en el 99,5% de sulfóxido dimetilo (DMSO; Wako) y añadidos al medio de diferenciación a concentraciones de 100 μM y 50 μM en menos del 0,1% de DMSO, respectivamente [30, 31]. Las proteínas de tipo salvaje y mutante IFITM5 también fueron producidas utilizando un sistema de expresión recombinante E. coli. Las células E. coli BL21(DE3) transformadas por la expresión plásmido fueron cultivadas a 37°C en medio LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Después de cuatro horas de inducción por 1 mM isopropil β-Dtiogalactopiranoside (IPTG), las células fueron recolectadas por centrifugación (6.400 × g durante 10 min a 4°C). Las células fueron suspendidas en 50 mM tampón Tris-HCl (pH 8) y interrumpidas por una prensa francesa (Ohtake, Tokio, Japón) (100 MPa × 4 veces). La fracción de membrana bruta fue recolectada por ultracentrifugación (178.000 × g durante 90 min a 4°C). La fracción recolectada fue solubilizado con 1,5% n-dodecyl-β-Dmaltopiranoside (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Japón) en 50 mM Tris-HCl, pH 8, que contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante fue incubado con resina de agarosa Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). La resina fue aplicada a una columna de cromatografía y lavada con 50 mM imidazol que contenía 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl y 0,1% DDM. El IFITM5 solubilizado con DDM fue recolectado por elución con el mismo tampón que contenía 0,3 M imidazol. Los medios de muestreo fueron reemplazados por la solución tampón apropiada por dos pasajes sobre una columna PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Inglaterra). Los detalles experimentales se describen en informes anteriores [19, 28]. Brevemente, se extrajeron proteínas totales de las células osteoblásticas que coexpresaron IFITM5 y FKBP11-FLAG utilizando un kit de extracción total de proteínas (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Luego, el lisato celular fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) a 4°C durante 2 h. Para recuperar FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × péptido FLAG (Sigma-Aldrich) disuelto en solución salina tris-buffered se añadió al gel recogido a 4°C durante 1 h. Las proteínas recuperadas y el lisato celular que contenía proteínas totales fueron analizados por SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y la mancha occidental El anticuerpo policlonal anti-IFITM5, preparado a partir de la secuencia péptida aminoterminal (TSYPREDPRAPSSRC), y el anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos primarios. Los anticuerpos anti-rabbit IgG (H+L) de cabra conjugados con HRP (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y anti-mouse IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) fueron utilizados como anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios anti-IFITM5 y anti-FLAG, respectivamente. Las proteínas fueron detectadas por reacción quimioluminiscente (MercK-Millipore, Billerica, MA). El lisato celular extraído de las células osteoblásticas marcadas metabólicamente por 17-ODYA fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG M2 para obtener proteínas purificadas con FLAG IFITM5. Las proteínas marcadas con 17-ODYA fueron etiquetadas químicamente con azida-PEG 3 -5(6)-carboxitetrametilrhodamina (TAMRA-azida; Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) con referencia a estudios previos [10, 29, 30, 32] y la guía del fabricante. Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron visualizadas utilizando un láser de 532-nm para excitación y la fluorescencia por TAMRA (565 nm) fue detectada mediante un filtro de largo camino de 575nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Las células de osteoblasto subcultivo MC3T3 fueron sembradas a una densidad de 5.000 células/cm 2 en platos de 40 mm y cultivadas en medio de águila α-modificada (α-MEM; Sigma-Aldrich) conteniendo 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón). Al día siguiente, esto fue reemplazado por medio de diferenciación, conteniendo 2 mM de glicerofosfato y 50 μg/ml de ascorbato sódico en concentraciones finales, para inducir la diferenciación osteoblasto. Cuando fue necesario, 100 μM 2BP en menos de 0,1% DMSO, o 0,1% DMSO solo se añadió al medio de diferenciación en concentraciones finales. Todos los cultivos fueron incubados a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% CO 2 durante Los nódulos mineralizados fueron manchados con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Se utilizó el procedimiento estándar de tinción. Los nódulos mineralizados fueron revisados cada tres días. Para identificar la palmitoilación S en IFITM5, las células osteoblásticas que albergaban el ADN plásmido que codificaba IFITM5-WT fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP, lo que inhibe la palmitoilación S (Figura 2-A) [31]. A continuación, se extrajo el lisato celular que contenía proteína total para su uso en los análisis de manchas SDS-PAGE y occidentales. A efectos de comparación, las células E. coli también fueron cultivadas en ausencia de 2BP y se extrajo el lisato celular. La Figura 2 -B muestra los resultados del ensayo de manchas occidentales para IFITM5-WT expresado en el osteo En las células de osteoblasto, IFITM5-WT exhibió una sola banda cerca del marcador de masa molecular de 17,4 kDa (ver carril 1) en ausencia de 2BP. Sin embargo, en presencia de 2BP (ver carril 4), la banda apareció en una posición más baja que en ausencia de 2BP (lane 1). Estos resultados sugieren que IFITM5-WT tiene formas de masa molecular alta y baja en ausencia y presencia de 2BP, respectivamente. La palmitoilación S es una reacción reversible, y por lo tanto es despalmitoilada por un reductor fuerte como la hidroxilamina [10]. Tras el tratamiento de hidroxilamina (ver carril 2), la banda apareció en la misma posición que en presencia de 2BP (lane 4). En las células prokaryote E. coli, la modificación post-translacional S-Palmitoylation en IFITM5 PLOS ONE www.plosone.org no se produce. Por lo tanto, la banda también se observó en la misma posición inferior (ver carril 3). En el caso de IFITM3, también se informó que la palmitoylation induce un cambio en la movilidad en la electroforesis, al igual que en nuestros resultados actuales [10]. Para la observación directa de la S-palmitoylation, se utilizó un reportero químico establecido, 17-ODYA (Figura 2-C). Las células osteoblastadas que albergan la codificación plasmídica IFITM5-WT fueron cultivadas en presencia de 17-ODYA para etiquetar la proteína metabólicamente. Después de la extracción y purificación del lisato celular, el IFITM5-WT etiquetado fue ligado con TAMRA-azida de acuerdo con el método de cicloadición de azidealkyne [3+2] catalizado Cu(I) [3+2] [10, 29, 30, 32 ]. Una imagen de fluorescencia en gel del IFITM5-WT marcado 17-ODYA-TAMRA (véase el carril 2 en la Figura 2 -D) mostró que IFITM5 estaba espalmitoilado en las células osteoblastadas. La etiqueta FLAG adjunta a IFITM5 no tiene influencia en la modificación y etiquetado químico (vías 1 y 5). Además, después del tratamiento con hidroxilamina (ver carril 6), la fluorescencia se debilitó debido a la disociación de 17-ODYA de IFITM5, que fue el mismo mecanismo que la disociación del ácido palmítico de IFITM5 por reducción como se describe anteriormente (lane 2 de la Figura 2-B). Por lo tanto, concluimos que el IFITM5 expresado en las células de osteoblasto nativas es S-palmitoilado. Además, las bandas correspondientes a las formas de masa molecular alta y baja mostradas en el análisis de manchas occidentales fueron asignadas tentativamente a las formas S-palmitoiladas y depalmitoiladas, respectivamente. Como se describe anteriormente en la Introducción, los residuos de cisteína son el sustrato para la palmitoilación S. IFITM5 posee tres cisteínas, Cys52 y Cys53 en el dominio TM1, y Cys86 en el bucle CP (Figura 1-A). Todas estas cisteínas están altamente conservadas entre las proteínas de la familia IFITM de mamíferos (Figura 3-A). Para identificar el sitio de modificación en IFITM5, preparamos mutantes substituidos por cisteína, IFITM5-C52A/C53A, -C86A, y -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Las células osteoblastadas que albergaban cada plasmido fueron cultivadas en ausencia de 2BP, y luego se extrajo el lisato celular. La Figura 3-B muestra los resultados de la mancha occidental detectando la expresión de todos los mutantes en las células osteoblastadas. En los mutantes C52A/C53A y Cys-less (ver carriles 2 y 4), se detectó la forma de baja masa molecular. Este resultado indica que Cys52 o Cys53 están involucrados en la palmitoilación S. Además, como se muestra en la Figura 2 -D, se detectaron fluorescencia fuerte y débil en el mutante C52A/C53A en ausencia y presencia de hidroxilamina (lanes 3 y 7), respectivamente, pero no en el mutante Cys-less (lanes 4 y 8). Estos resultados sugieren que el resto de la cisteína en el mutante C52A/C53A, Cys86, es S-palmitoilado y el mutante Cyss-less perdió por completo la palmitoilación S porque todas las cisteinas fueron sustituidas. Por lo tanto, concluimos que Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados. Además, se encontró que la S-palmitoilación en el dominio TM1 tiene un efecto importante en la movilidad en el gel (panel inferior de la Figura 2 -D y Figura 3-B). Por lo tanto, en adelante nos referimos a las formas de masa molecular alta y baja como las formas TM1palmitoiladas y TM1-depalmitoiladas, respectivamente. Finalmente, reasignamos las bandas mostradas en el análisis de Western blot como sigue: IFITM5-WT está totalmente palmitoilado, el mutante C86A está parcialmente palmitoilado en Cys52 y/o Cys53, el mutante C52A/C53A está parcialmente palmitoilado en Cys86, y el mutante sin Cys está completamente depalmitoilado. Estudios previos han revelado que IFITM5 interactúa con FKBP11 [19]. FKBP11 pertenece a la familia de proteínas de unión FK506 y tiene un dominio transmembrana. La interacción entre IFITM5 y FKBP11 es importante para la actividad inmunitaria debido a que la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP induce la expresión de genes inducidos por interferón, a saber, el Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de MHC [28]. Para investigar el efecto de la palmitoilación S en la interacción de IFITM5 con FKBP11, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Las células osteoblásticas cotransfectadas por los plásmidos que codifican IFITM5-WT y FKBP11-FLAG fueron cultivadas en ausencia y presencia de 2BP. Luego, el análisis celular extraído fue incubado con gel de agarosa anti-FLAG. El gel fue lavado varias veces. Finalmente, las proteínas fueron eludidas competitivamente por la adición de péptido FLAG. Si IFITM5 interactuaba con FKBP11, se esperaba que IFITM5 Las cisteínas conservadas fueran resaltadas en naranja y numeradas. En el panel inferior, los números dados entre paréntesis corresponden al número residual para IFITM2. Para el cálculo de probabilidad, un total de 23 secuencias IFITM2, 23 IFITM3 y 17 IFITM5 derivadas de especies mamíferas en la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) fueron utilizadas. La alineación de secuencias se llevó a cabo utilizando CLUSTALW. Los logotipos de secuencia se generaron utilizando WEBLOGO 3. B) Botón occidental para los mutantes de tipo salvaje y substituidos por cisteína de IFITM5 expresados en células osteoblastadas La flecha superior indica que los mutantes C52 y/o C53 en el dominio TM1 son Spalmitoylated (lanes 1 y 3). El C52A/C53A (lane 2) y Cys-less (lane 4) son parcial y completamente depalmitoylated. El experimento se llevó a cabo 2 veces. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 se obtendría durante este paso y se detectaría por inmunobloqueo. Figura 4 -A muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de IFITM5-WT con FKBP-FLAG. La banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (panel superior). Las lanes 1 y 2 son controles para asegurar que IFITM5 y FKBP11 estén contenidas en el lisato celular Los controles también aseguraron que el IFITM5 fuera palmitoilado S en ausencia de 2BP (ver carril 1), mientras que el IFITM5 no fue palmitoilado S en presencia de 2BP (ver carril 2). Después de la inmunoprecipitación, una sola banda correspondiente al IFITM5 palmitoilado S apareció en ausencia de 2BP (ver carril 3), indicando la interacción del IFITM5 espalmitoilado con el FKBP11. Sin embargo, en presencia de 2BP, no apareció ninguna banda correspondiente al IFITM5 (ver carril 4), indicando que las dos moléculas no interactúan entre sí. Estos resultados sugieren que la palmitoilación S sobre el IFITM5 contribuye a la interacción con el FKBP11. A continuación, investigamos la relación entre la Spalmitoylation y la interacción con FKBP11 utilizando los mutantes IFITM5 descritos anteriormente. Las células osteoblastadas cotransfectadas por los plásmidos que codifican los mutantes IFITM5 (C52A/ C53A, C86A y Cys-less) y FKBP11-FLAG fueron cultivadas. El ensayo de inmunoprecipitación se llevó a cabo de la misma manera que se describió anteriormente. La Figura 4 -B muestra los resultados de la mancha occidental para la co-inmunoprecipitación de los mutantes de tipo salvaje y el IFITM5 con FKBP11. La Figura 4 -C muestra los resultados del experimento de control utilizando el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. Como se describe en la sección anterior 3-3, la banda correspondiente a FKBP11 apareció en todos los carriles (paneles superiores) porque la inmunoprecipitación se realizó utilizando el gel de agarosa anti-FLAG. En el panel inferior de la Figura 4 -B, se observaron bandas individuales para el mutante IFITM5-WT y -C86A (lanes 1 y 3) pero no para los mutantes -C52A/C53A y Cys-less (lanes 2 y 4). Este resultado indica que el tipo salvaje y el mutante C86A interactúan con FKBP11, mientras que los otros dos mutantes no lo hacen. Curiosamente, esta tendencia refleja la tendencia de los perfiles de palmitoilación S, lo que significa que Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 de los mutantes IFITM5-WT y -C86A es S-palmitoilado, mientras que estos residuos no son S-palmitoilados en los mutantes C52A/C53A y Cysless (ver Figuras 2-D, 3-B y el panel inferior de la Figura 4-C). Debido a que la palmitoilación S contribuye a la interacción IFITM5-FKBP11, como se describe en la sección anterior 3-3 (también en la Figura 4-A), los resultados de la Figura 4-B sugieren que los mutantes que perdieron el sitio(s) de palmitoilación S, Cys52 y/o Cys53, no son capaces de interactuar con FKB En otras palabras, la palmitoilación S en estas cisteínas es necesaria para la interacción de IFITM5 con FKBP11. Como se ha descrito anteriormente en la Introducción, estudios previos han revelado que IFITM5 también contribuye a la formación ósea [18] [19] [20]. Por lo tanto, se investigó la influencia de Spalmitoilación en la formación de nódulos óseos en células osteoblastadas, en las que se expresa IFITM5 nativas. La Figura 5 muestra la formación de nódulos dependientes del tiempo en ausencia y la presencia de 2BP (Figuras 5-A y -B). La Figura 5 -C muestra los resultados del ensayo de control para verificar el efecto de DMSO, que se utilizó como disolvente para 2BP, en la formación de nódulos. El nódulo mineralizado fue manchado con Alizarin Red, que reacciona con calcio depositado. En la Figura 5 -D, el área del nódulo mineralizado fue trazada contra el tiempo experimental. En ausencia de 2BP (Figura 5-A, -C, y -D), la mineralización se inició 15 días después del inicio de la diferenciación celular (Día 0). Por otro lado, en presencia de 2BP (Figura 5-B y -D) se formó el nódulo el Día 12. El tiempo medio para la mineralización máxima en presencia de 2BP se estimó 7 días antes que en ausencia de 2BP (Figura 5-D). Además, se observaron diferencias en la forma de los nódulos mineralizados. La Figura 5 -E muestra una visión ampliada de cada nódulo en el Día 21. Los nódulos manchados se difundieron en presencia de 2BP (panel b), mientras que en ausencia de 2BP los nódulos formaron un gran cúmulo (panels a y c). Por lo tanto, nuestras observaciones en este estudio sugieren que la S-palmitoilación afecta la formación de nódulos óseos en las células osteoblásticas. En este estudio, se confirmó la S-palmitoilación sobre IFITM5 en las células osteoblásticas, que fue la misma que la reportada previamente para IFITM3 e IFITM2. Como se informó anteriormente, en IFITM3 e IFITM2, que comparten similitud de secuencia del 85% (Figura 1-C), dos cisteínas en el dominio TM1 (Cys71 y Cys72 para IFITM3, Cys70 y Cys71 para IFITM2) y una cisteína en el bucle CP (Cys105 para IFITM3, Cys104 para IFITM2) son todas S-palmitoiladas en células [10, 24]. Por otro lado, aunque IFITM5 comparte similitud de secuencia del 68% y 66% a IFITM3 e IFITM2, respectivamente, más de una cisteína en el dominio TM1 (Cys52 o Cys53) y una cisteína en el bucle CP (Cys86) son S-palmitoiladas. Teniendo en cuenta la alta conservación de tres cisteínas en las proteínas IFITM (Figuras 1-A y 3-A), todas las cisteínas en IFITM5 pueden estar involucradas en la palmitoilación S al igual que en el caso de IFITM3 e IFITM2 [10, 24]. Los roles de la palmitoilación S en IFITM3 se han estudiado intensamente, y la palmitoilación S ha demostrado ser crucial para el correcto posicionamiento en la membrana y la resistencia a la infección viral y la internalización [10] (los papeles se resumen en la Figura 6-A y se discuten en detalle más adelante). Un estudio reciente ha revelado que la palmitoilación S en IFITM2 también es importante para la agrupación de proteínas en la membrana [24]. Sin embargo, no conocemos el papel de la Spalmitoylation de IFITM5 para el agrupamiento en la membrana en la actualidad porque todavía no hemos logrado obtener un anticuerpo adecuado para la inmunohistoquímica, a pesar de que dedicamos mucho tiempo a la búsqueda y considerando un número considerable de anticuerpos. El Dr. Hanagata y sus colaboradores reportaron previamente que IFITM5 carecían del dominio TM1 y del bucle CP, que y IFITM5 (paneles inferiores), los anticuerpos anti-FLAG y anti-IFITM5 fueron utilizados como anticuerpos primarios, respectivamente. Las flechas indican la existencia de cada proteína y la S-palmitoylation en IFITM5. A) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje IFITM5 con el FKBP11 (FKBP11-FLAG) fusionado con FLAG en las células osteoblásticas en ausencia y presencia de 2BP (denominadas "-" y "+", respectivamente). Las vías 1 y 2 son los resultados de los ensayos de control utilizados para verificar la existencia de IFITM5 y FKBP11 antes de la inmunoprecipitación, y las vías 3 y 4 muestran los resultados después de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 3 veces. B) La mancha occidental para la coinmunoprecipitación del tipo salvaje y los mutantes substituidos por cisteína de IFITM5 con FKBP11-FLAG en las células osteoblásticas. La banda correspondiente al péptido FLAG no se muestra debido a la menor masa molecular del péptido FLAG en relación con FKBP11-FLAG. C) El experimento de control de la Figura 4 -B utilizado para verificar que IFITM5 y FKBP11 estaban presentes en el lisato celular antes de la inmunoprecipitación. El experimento se repitió 2 veces. A) El mecanismo funcional de IFITM3 se resume en estudios anteriores. i) IFITM3 es S-palmitoilado en Cys71, Cys72 y Cys105, ii) que induce el agrupamiento y el posicionamiento correcto en la membrana, iii) resultando en la actividad antiviral contra el virus de la gripe. B) El mecanismo funcional de IFITM5 se resume combinando los resultados del presente y los estudios anteriores. (i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). La S-palmitoilación permite que IFITM5 interactúe con FKBP11 en las células osteoblásticas (iii). La disociación del CD9 del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 es inducida por la formación del complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y conduce a la expresión genética inmunológicamente relevante. IFITM5 también contribuye a la formación ósea, pero se desconoce cuáles son los estados descritos en i)-iii) son importantes para la formación ósea en la actualidad. Por otro lado, la IFITM5 interactúa con la proteína asociada, FKBP11, y la S-palmitoylation claramente hace una contribución significativa a la interacción. Por lo tanto, IFITM5 forma un hetero-oligomero en la membrana celular para su función fisiológica. contiene los sitios de modificación relevantes, perdió la capacidad de interactuar con FKBP11 [19]. En el presente estudio, determinamos que la S-palmitoylation en Cys52 y/o Cys53 en el dominio TM1 es necesaria para la interacción. De estos resultados, especulamos que Cys52 y Cys53 se enfrentan a la superficie de interacción con FKBP11, y por lo tanto IFITM5 y FKBP11 interactúan entre sí a través del ácido palmítico unido a la cisteína (resumidos en la Figura 6 -B, discutidos más Nuestra investigación reveló que Cys86 está involucrado en la Spalmitoylation pero no contribuye a la interacción con FKBP11. Especulamos que otros residuos en el bucle CP ubicados cerca del dominio TM1 hacen alguna contribución a la interacción. Investigaciones previas también revelaron que IFITM5 expresado en las células fibroblasto heterologosas NIH3T3 exhibieron interacciones directas con CD81, la proteína 31 asociada al receptor de células B (BCAP31) y el hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (HSD17b7). Estas tres proteínas se unen al IFITM5 sin la S-palmitoylation (forma de masa molecular baja; ver Figura 3-b en ref [19]. y Figura 1-B en ref [28]. En las células fibroblastosas, la S-palmitoylation en IFI Estas interacciones no se observan en las células nativas del osteoblasto y, por lo tanto, son inespecíficas. Teniendo en cuenta estos hechos, se especula que la palmitoilación S sobre las células del IFITM5 promueve la interacción específica con FKBP11 en las células del osteoblasto. El papel que desempeña la palmitoilación S de las células del IFITM5 en la actividad inmune de las células del osteoblasto se discutirá combinando los resultados del presente y de los estudios anteriores. Debe ser necesaria una interacción específica entre IFITM5 y FKBP11 para formar el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. CD81, también conocido como TAPA-1, es un miembro de la familia de proteínas de membrana de tetraspanina y un componente del núcleo de células B que media la señalización de células B para respuestas inmunes. Al formar este complejo, CD9, una proteína asociada con CD81, disociada del complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 y consecuentemente induce la expresión osteoblastada específica de los genes inducidos por interferón, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m y el gen antígeno clase I de la MHC [28]. Si se perdiera la interacción específica mediada por Spalmitoylation de IFITM5 con FKBP11, no se formaría el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP y, por consiguiente, se inhibiría la expresión génica inducida por interferón, ya que el CD9 seguiría asociado con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9. En este sentido, especulamos que el IFITM5 está involucrado en la actividad del sistema inmunitario en las células osteoblastadas y la interacción del IFITM5 palmitoilado S con el FKBP11 regula la actividad inmune. Además, se sugirió que la S-palmitoilación en el IFITM5 contribuye a la formación de nódulos óseos, incluyendo la morfología y el tiempo de mineralización, en las células osteoblastadas (Figura 5). Es difícil concluir en la actualidad que la falta de la S-palmitoilación en el IFITM5 causa la difusión de los nódulos óseos (panel b de la Figura 5 -E); sin embargo, podemos decir que el IFITM5 probablemente no será S-palmitoilado en las células en presencia de 2BP. Mientras que el 2BP se utiliza comúnmente como inhibidor de la palmitoilación, también se dirige a muchas enzimas Por lo tanto, también es difícil interpretar los resultados de la incubación a largo plazo de las células osteoblásticas en presencia de 2BP. En cualquier caso, estas son observaciones interesantes y clave en términos de aclarar el papel desempeñado por la S-palmitoilación de IFITM5 en la formación ósea, y se requieren estudios adicionales. La Figura 6 describe un posible mecanismo de la interacción de IFITM5 con FKBP11 y el papel de IFITM5 en la función celular osteoblástica mediante una comparación con IFITM3. En el caso de IFITM3, como se muestra en la Figura 6 -A, se observan los siguientes. i) Las tres cisteinas son todas S-palmitoiladas (ii). La S-palmitoilación conduce a la agrupación y el posicionamiento correcto de moléculas IFITM3 en la membrana (iii). La espalmitoilación y la siguiente agrupación son cruciales para la resistencia al virus de la gripe. Cuando IFITM3 carece de la espalmitoilación, las moléculas de IFITM3 no se agrupan, lo que conduce a la disminución significativa de la actividad antiviral. Por otro lado, la Figura 6 -B muestra que las siguientes observaciones se hacen en el caso de IFITM5. i) Cys86, más uno o dos otros residuos de cisteína en IFITM5, es decir, Cys52 y/o Cys53, son S-palmitoilados (ii). El S-palmitoilado IFITM5 es capaz de interactuar específicamente con FKBP11. Se supone que la interacción está mediada por el ácido palmítico unido a la cisteína frente a la superficie de interacción en FKBP11. Cys86 está involucrado en la palmitoilación S, pero no en la interacción de IFITM5 con FKBP11. En la actualidad, sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la palmitoilación S de IFITM5 para la localización en la membrana. Cuando la palmitoilación S afecta la localización de IFITM5 como en el caso de IFITM3 [10], las moléculas S-palmitoiladas IFITM5 deben ser localizadas en la membrana o las moléculas depalmitoiladas deben ser deslocalizadas. La pérdida de la interacción entre IFITM5 y FKBP11 podría deberse a una relocalización de la depalmitoilada IFITM5 que impide su asociación con FKBP11 (iii). El Spalmitoilado IFITM5 interactúa con el complejo FKBP11-CD81-FPRP/CD9 a través del FKBP11, que induce la disociación del CD9 del complejo y la expresión de 5 genes inmunológicamente relevantes. Finalmente, el IFITM5 forma el complejo IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Se desconoce en la actualidad cuál de los tres estados (i)~(iii) ilustrados en la Figura 6-B es importante para la mineralización ósea de las células osteoblásticas. La falta de la S-palmitoilación influye en la interacción con el FKBP11, que podría explicar la siguiente formación compleja y expresión génica. Además, la formación de nódulos óseos también se ve afectada. Se indica que la S-palmitoilación en IFITM5 juega un papel no sólo en la regulación de la actividad inmune sino también en la formación ósea. En conclusión, hemos revelado la S-palmitoilación en IFITM5 y su papel en la interacción con FKBP11. No sólo la actividad inmune sino también la mineralización ósea en las células osteoblásticas se ve afectada por la S-palmitoilación. En general, el papel funcional de la S-palmitoilación es diferente para cada proteína [36]. Para muchas proteínas, el ciclo de palmitoilación y despalmitoilación es constitutivo y regulado por enzimas. Basado en los resultados actuales, es difícil abordar (i) si la S-palmitoilación en IFITM5 es constitutiva o regulada, o (ii) cuando y donde IFITM5 es S-palmitoilada en las células osteoblásticas. Se necesitan más estudios y actualmente se están realizando.
|
¿Qué aminoácido podría estar involucrado en la unión al calcio en la región C-terminal de una proteína?
| false
| 580
|
{
"text": [
"aspartate"
],
"answer_start": [
6817
]
}
|
aspartato
|
1,546
|
Primera secuencia completa del genoma de una cepa del coronavirus bovino francéshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5477389/SHA: eef0ecf5b8e7b179dadaef967e65f2ab68f021e1Autores: Kin, Nathalie; Guerard, Pauline; Diancourt, Laure; Caro, Valérie; Vabret, Astrid; Ar Gouilh, MeriadegFecha: 2017-05-25DOI: 10.1128/genomea.00319-17Licencia: cc-byAbstract: Secuenciamos la primera secuencia completa del genoma de Bovine (BCoV) de Francia. Esta BCoV fue secuenciada directamente a partir de una muestra fecal recolectada de un becerro en Normandía Texto: El coronavirus ovino B (BCoV) pertenece al orden Nidovirales, a la familia Coronaviridae, a la subfamilia Coronavirinae y al betacoronavirus (https://talk.ictvonline.org/ ICTV/propostions/2008.085-122V.v4.Coronaviridae.pdf). Su genoma es un ARN de una sola cadena, lineal y no segmentado de alrededor de 31 kb. BCoV es responsable de enfermedades respiratorias y entéricas en el ganado bovino, particularmente durante el invierno (1, 2). Hasta la fecha, las 19 secuencias completas del genoma BCoV disponibles en las bases de datos GenBank (consultadas el 17 de enero de 2017) originadas en Estados Unidos o Asia. Aquí informamos de la primera secuencia completa del genoma de un BCoV detectado en Francia. La cepa BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 se obtuvo de una muestra fecal recolectada de un ternero de 1 semana de edad en Normandía en 2014. La presencia de BCoV en la muestra fecal se evaluó utilizando una transcripción inversa interna-PCR (RT-PCR) dirigida al gen M (3). Se sintetizó una biblioteca de cDNA utilizando SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y hexameros. La secuenciación completa del genoma de los productos PCR superpuestos se llevó a cabo en ambas direcciones, utilizando imprimadores originales y la secuenciación dideoxida de Sanger. Se realizaron reacciones secuenciales como se describió previamente (3). Se montaron secuencias y se anotó utilizando el software Geneious (versión 5.1.6). Obtuvimos una secuencia contando 30.847 nucleótidos. Los genes orf1ab, HE, S, ns5, E, M y N del BCoV obtenido fueron sometidos a un análisis de Blastn. De acuerdo con estos análisis, el gen orf1ab (20kb nucleótidos, localizado en el lado 5= del genoma) está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F cepa de los Emiratos Árabes Unidos (adhesión no KF906251), con una identidad nucleótida de 99,19%. Por el contrario, los genes NS2, HE, S, ns5, y M están estrechamente relacionados con la cepa BCoV Bubalus/Italia/179/07-11 (adhesión no EU019216), con identidades nucleótidas de 99,88, 99,45%, 99,02%, 98,79% El gen E está estrechamente relacionado con la cepa china del coronavirus bovino BCV-AKS-01 (adhesión no. KU886219), con una identidad de nucleótidos del 100%. Finalmente, se encontró la puntuación más alta de Blastn para el gen N con el BCoV-ENT entérico americano (adhesión no. AF391541), asociado con una identidad de nucleótidos del 100%. La alineación de múltiples secuencias, incluyendo 20 BCoV y 10 clado Un betacoronavirus estrechamente relacionado con BCoV de América del Norte, dos DcCoV de los Emiratos Árabes Unidos, y dos cepas del coronavirus humano OC43 (HCoV-OC43) de Francia, se realizó utilizando el algoritmo muscular implementado en MEGA7 (4, 5). El análisis filogenético sobre el orf1ab confirma que BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F. El gen orf1ab de estos dos virus agrupados por separado de los virus de BCoV y BCoV similares a los de América del Norte y Asia. Este hallazgo también confirma los resultados de nuestro análisis previo sobre genomas parciales en los que los genes nsp12, S y N de BCoVs americanos y asiáticos se agrupan en un grupo llamado tentativamente C 1. Las regiones de codificación nsp12 y N de BCoVs de Francia y DcCoVs de los Emiratos Árabes Unidos agrupados en C 2. El gen DcCoV S individualizado a partir de ambos genes HCoV-OC43 y BCoV Los posibles eventos de recombinación podrían estar en el origen de DcCoV. Número(s) de adhesión. La secuencia completa de secuencia del genoma del aislado BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 ha sido depositada en GenBank bajo el número de adhesión KX982264.
|
¿Cuál es el tamaño del coronavirus bovino?
| false
| 917
|
{
"text": [
"31 kb"
],
"answer_start": [
840
]
}
|
31 kb
|
1,546
|
Primera secuencia completa del genoma de una cepa del coronavirus bovino francéshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5477389/SHA: eef0ecf5b8e7b179dadaef967e65f2ab68f021e1Autores: Kin, Nathalie; Guerard, Pauline; Diancourt, Laure; Caro, Valérie; Vabret, Astrid; Ar Gouilh, MeriadegFecha: 2017-05-25DOI: 10.1128/genomea.00319-17Licencia: cc-byAbstract: Secuenciamos la primera secuencia completa del genoma de Bovine (BCoV) de Francia. Esta BCoV fue secuenciada directamente a partir de una muestra fecal recolectada de un becerro en Normandía Texto: El coronavirus ovino B (BCoV) pertenece al orden Nidovirales, a la familia Coronaviridae, a la subfamilia Coronavirinae y al betacoronavirus (https://talk.ictvonline.org/ ICTV/propostions/2008.085-122V.v4.Coronaviridae.pdf). Su genoma es un ARN de una sola cadena, lineal y no segmentado de alrededor de 31 kb. BCoV es responsable de enfermedades respiratorias y entéricas en el ganado bovino, particularmente durante el invierno (1, 2). Hasta la fecha, las 19 secuencias completas del genoma BCoV disponibles en las bases de datos GenBank (consultadas el 17 de enero de 2017) originadas en Estados Unidos o Asia. Aquí informamos de la primera secuencia completa del genoma de un BCoV detectado en Francia. La cepa BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 se obtuvo de una muestra fecal recolectada de un ternero de 1 semana de edad en Normandía en 2014. La presencia de BCoV en la muestra fecal se evaluó utilizando una transcripción inversa interna-PCR (RT-PCR) dirigida al gen M (3). Se sintetizó una biblioteca de cDNA utilizando SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y hexameros. La secuenciación completa del genoma de los productos PCR superpuestos se llevó a cabo en ambas direcciones, utilizando imprimadores originales y la secuenciación dideoxida de Sanger. Se realizaron reacciones secuenciales como se describió previamente (3). Se montaron secuencias y se anotó utilizando el software Geneious (versión 5.1.6). Obtuvimos una secuencia contando 30.847 nucleótidos. Los genes orf1ab, HE, S, ns5, E, M y N del BCoV obtenido fueron sometidos a un análisis de Blastn. De acuerdo con estos análisis, el gen orf1ab (20kb nucleótidos, localizado en el lado 5= del genoma) está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F cepa de los Emiratos Árabes Unidos (adhesión no KF906251), con una identidad nucleótida de 99,19%. Por el contrario, los genes NS2, HE, S, ns5, y M están estrechamente relacionados con la cepa BCoV Bubalus/Italia/179/07-11 (adhesión no EU019216), con identidades nucleótidas de 99,88, 99,45%, 99,02%, 98,79% El gen E está estrechamente relacionado con la cepa china del coronavirus bovino BCV-AKS-01 (adhesión no. KU886219), con una identidad de nucleótidos del 100%. Finalmente, se encontró la puntuación más alta de Blastn para el gen N con el BCoV-ENT entérico americano (adhesión no. AF391541), asociado con una identidad de nucleótidos del 100%. La alineación de múltiples secuencias, incluyendo 20 BCoV y 10 clado Un betacoronavirus estrechamente relacionado con BCoV de América del Norte, dos DcCoV de los Emiratos Árabes Unidos, y dos cepas del coronavirus humano OC43 (HCoV-OC43) de Francia, se realizó utilizando el algoritmo muscular implementado en MEGA7 (4, 5). El análisis filogenético sobre el orf1ab confirma que BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F. El gen orf1ab de estos dos virus agrupados por separado de los virus de BCoV y BCoV similares a los de América del Norte y Asia. Este hallazgo también confirma los resultados de nuestro análisis previo sobre genomas parciales en los que los genes nsp12, S y N de BCoVs americanos y asiáticos se agrupan en un grupo llamado tentativamente C 1. Las regiones de codificación nsp12 y N de BCoVs de Francia y DcCoVs de los Emiratos Árabes Unidos agrupados en C 2. El gen DcCoV S individualizado a partir de ambos genes HCoV-OC43 y BCoV Los posibles eventos de recombinación podrían estar en el origen de DcCoV. Número(s) de adhesión. La secuencia completa de secuencia del genoma del aislado BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 ha sido depositada en GenBank bajo el número de adhesión KX982264.
|
¿Cuál es la estructura molecular del coronavirus bovino?
| false
| 918
|
{
"text": [
"single-stranded, linear, and nonsegmented RNA"
],
"answer_start": [
784
]
}
|
ARN monofilamento, lineal y no segmentado
|
1,546
|
Primera secuencia completa del genoma de una cepa del coronavirus bovino francéshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5477389/SHA: eef0ecf5b8e7b179dadaef967e65f2ab68f021e1Autores: Kin, Nathalie; Guerard, Pauline; Diancourt, Laure; Caro, Valérie; Vabret, Astrid; Ar Gouilh, MeriadegFecha: 2017-05-25DOI: 10.1128/genomea.00319-17Licencia: cc-byAbstract: Secuenciamos la primera secuencia completa del genoma de Bovine (BCoV) de Francia. Esta BCoV fue secuenciada directamente a partir de una muestra fecal recolectada de un becerro en Normandía Texto: El coronavirus ovino B (BCoV) pertenece al orden Nidovirales, a la familia Coronaviridae, a la subfamilia Coronavirinae y al betacoronavirus (https://talk.ictvonline.org/ ICTV/propostions/2008.085-122V.v4.Coronaviridae.pdf). Su genoma es un ARN de una sola cadena, lineal y no segmentado de alrededor de 31 kb. BCoV es responsable de enfermedades respiratorias y entéricas en el ganado bovino, particularmente durante el invierno (1, 2). Hasta la fecha, las 19 secuencias completas del genoma BCoV disponibles en las bases de datos GenBank (consultadas el 17 de enero de 2017) originadas en Estados Unidos o Asia. Aquí informamos de la primera secuencia completa del genoma de un BCoV detectado en Francia. La cepa BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 se obtuvo de una muestra fecal recolectada de un ternero de 1 semana de edad en Normandía en 2014. La presencia de BCoV en la muestra fecal se evaluó utilizando una transcripción inversa interna-PCR (RT-PCR) dirigida al gen M (3). Se sintetizó una biblioteca de cDNA utilizando SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y hexameros. La secuenciación completa del genoma de los productos PCR superpuestos se llevó a cabo en ambas direcciones, utilizando imprimadores originales y la secuenciación dideoxida de Sanger. Se realizaron reacciones secuenciales como se describió previamente (3). Se montaron secuencias y se anotó utilizando el software Geneious (versión 5.1.6). Obtuvimos una secuencia contando 30.847 nucleótidos. Los genes orf1ab, HE, S, ns5, E, M y N del BCoV obtenido fueron sometidos a un análisis de Blastn. De acuerdo con estos análisis, el gen orf1ab (20kb nucleótidos, localizado en el lado 5= del genoma) está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F cepa de los Emiratos Árabes Unidos (adhesión no KF906251), con una identidad nucleótida de 99,19%. Por el contrario, los genes NS2, HE, S, ns5, y M están estrechamente relacionados con la cepa BCoV Bubalus/Italia/179/07-11 (adhesión no EU019216), con identidades nucleótidas de 99,88, 99,45%, 99,02%, 98,79% El gen E está estrechamente relacionado con la cepa china del coronavirus bovino BCV-AKS-01 (adhesión no. KU886219), con una identidad de nucleótidos del 100%. Finalmente, se encontró la puntuación más alta de Blastn para el gen N con el BCoV-ENT entérico americano (adhesión no. AF391541), asociado con una identidad de nucleótidos del 100%. La alineación de múltiples secuencias, incluyendo 20 BCoV y 10 clado Un betacoronavirus estrechamente relacionado con BCoV de América del Norte, dos DcCoV de los Emiratos Árabes Unidos, y dos cepas del coronavirus humano OC43 (HCoV-OC43) de Francia, se realizó utilizando el algoritmo muscular implementado en MEGA7 (4, 5). El análisis filogenético sobre el orf1ab confirma que BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F. El gen orf1ab de estos dos virus agrupados por separado de los virus de BCoV y BCoV similares a los de América del Norte y Asia. Este hallazgo también confirma los resultados de nuestro análisis previo sobre genomas parciales en los que los genes nsp12, S y N de BCoVs americanos y asiáticos se agrupan en un grupo llamado tentativamente C 1. Las regiones de codificación nsp12 y N de BCoVs de Francia y DcCoVs de los Emiratos Árabes Unidos agrupados en C 2. El gen DcCoV S individualizado a partir de ambos genes HCoV-OC43 y BCoV Los posibles eventos de recombinación podrían estar en el origen de DcCoV. Número(s) de adhesión. La secuencia completa de secuencia del genoma del aislado BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 ha sido depositada en GenBank bajo el número de adhesión KX982264.
|
¿Cuántos nucleótidos contiene el coronavirus bovino?
| false
| 919
|
{
"text": [
"30,847 nucleotides"
],
"answer_start": [
1873
]
}
|
30.847 nucleótidos
|
1,546
|
Primera secuencia completa del genoma de una cepa del coronavirus bovino francéshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5477389/SHA: eef0ecf5b8e7b179dadaef967e65f2ab68f021e1Autores: Kin, Nathalie; Guerard, Pauline; Diancourt, Laure; Caro, Valérie; Vabret, Astrid; Ar Gouilh, MeriadegFecha: 2017-05-25DOI: 10.1128/genomea.00319-17Licencia: cc-byAbstract: Secuenciamos la primera secuencia completa del genoma de Bovine (BCoV) de Francia. Esta BCoV fue secuenciada directamente a partir de una muestra fecal recolectada de un becerro en Normandía Texto: El coronavirus ovino B (BCoV) pertenece al orden Nidovirales, a la familia Coronaviridae, a la subfamilia Coronavirinae y al betacoronavirus (https://talk.ictvonline.org/ ICTV/propostions/2008.085-122V.v4.Coronaviridae.pdf). Su genoma es un ARN de una sola cadena, lineal y no segmentado de alrededor de 31 kb. BCoV es responsable de enfermedades respiratorias y entéricas en el ganado bovino, particularmente durante el invierno (1, 2). Hasta la fecha, las 19 secuencias completas del genoma BCoV disponibles en las bases de datos GenBank (consultadas el 17 de enero de 2017) originadas en Estados Unidos o Asia. Aquí informamos de la primera secuencia completa del genoma de un BCoV detectado en Francia. La cepa BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 se obtuvo de una muestra fecal recolectada de un ternero de 1 semana de edad en Normandía en 2014. La presencia de BCoV en la muestra fecal se evaluó utilizando una transcripción inversa interna-PCR (RT-PCR) dirigida al gen M (3). Se sintetizó una biblioteca de cDNA utilizando SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y hexameros. La secuenciación completa del genoma de los productos PCR superpuestos se llevó a cabo en ambas direcciones, utilizando imprimadores originales y la secuenciación dideoxida de Sanger. Se realizaron reacciones secuenciales como se describió previamente (3). Se montaron secuencias y se anotó utilizando el software Geneious (versión 5.1.6). Obtuvimos una secuencia contando 30.847 nucleótidos. Los genes orf1ab, HE, S, ns5, E, M y N del BCoV obtenido fueron sometidos a un análisis de Blastn. De acuerdo con estos análisis, el gen orf1ab (20kb nucleótidos, localizado en el lado 5= del genoma) está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F cepa de los Emiratos Árabes Unidos (adhesión no KF906251), con una identidad nucleótida de 99,19%. Por el contrario, los genes NS2, HE, S, ns5, y M están estrechamente relacionados con la cepa BCoV Bubalus/Italia/179/07-11 (adhesión no EU019216), con identidades nucleótidas de 99,88, 99,45%, 99,02%, 98,79% El gen E está estrechamente relacionado con la cepa china del coronavirus bovino BCV-AKS-01 (adhesión no. KU886219), con una identidad de nucleótidos del 100%. Finalmente, se encontró la puntuación más alta de Blastn para el gen N con el BCoV-ENT entérico americano (adhesión no. AF391541), asociado con una identidad de nucleótidos del 100%. La alineación de múltiples secuencias, incluyendo 20 BCoV y 10 clado Un betacoronavirus estrechamente relacionado con BCoV de América del Norte, dos DcCoV de los Emiratos Árabes Unidos, y dos cepas del coronavirus humano OC43 (HCoV-OC43) de Francia, se realizó utilizando el algoritmo muscular implementado en MEGA7 (4, 5). El análisis filogenético sobre el orf1ab confirma que BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F. El gen orf1ab de estos dos virus agrupados por separado de los virus de BCoV y BCoV similares a los de América del Norte y Asia. Este hallazgo también confirma los resultados de nuestro análisis previo sobre genomas parciales en los que los genes nsp12, S y N de BCoVs americanos y asiáticos se agrupan en un grupo llamado tentativamente C 1. Las regiones de codificación nsp12 y N de BCoVs de Francia y DcCoVs de los Emiratos Árabes Unidos agrupados en C 2. El gen DcCoV S individualizado a partir de ambos genes HCoV-OC43 y BCoV Los posibles eventos de recombinación podrían estar en el origen de DcCoV. Número(s) de adhesión. La secuencia completa de secuencia del genoma del aislado BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 ha sido depositada en GenBank bajo el número de adhesión KX982264.
|
¿Cuál es el tamaño del gen orf1ab en el coronavirus bovino?
| false
| 920
|
{
"text": [
"20kb"
],
"answer_start": [
2034
]
}
|
20kb
|
1,546
|
Primera secuencia completa del genoma de una cepa del coronavirus bovino francéshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5477389/SHA: eef0ecf5b8e7b179dadaef967e65f2ab68f021e1Autores: Kin, Nathalie; Guerard, Pauline; Diancourt, Laure; Caro, Valérie; Vabret, Astrid; Ar Gouilh, MeriadegFecha: 2017-05-25DOI: 10.1128/genomea.00319-17Licencia: cc-byAbstract: Secuenciamos la primera secuencia completa del genoma de Bovine (BCoV) de Francia. Esta BCoV fue secuenciada directamente a partir de una muestra fecal recolectada de un becerro en Normandía Texto: El coronavirus ovino B (BCoV) pertenece al orden Nidovirales, a la familia Coronaviridae, a la subfamilia Coronavirinae y al betacoronavirus (https://talk.ictvonline.org/ ICTV/propostions/2008.085-122V.v4.Coronaviridae.pdf). Su genoma es un ARN de una sola cadena, lineal y no segmentado de alrededor de 31 kb. BCoV es responsable de enfermedades respiratorias y entéricas en el ganado bovino, particularmente durante el invierno (1, 2). Hasta la fecha, las 19 secuencias completas del genoma BCoV disponibles en las bases de datos GenBank (consultadas el 17 de enero de 2017) originadas en Estados Unidos o Asia. Aquí informamos de la primera secuencia completa del genoma de un BCoV detectado en Francia. La cepa BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 se obtuvo de una muestra fecal recolectada de un ternero de 1 semana de edad en Normandía en 2014. La presencia de BCoV en la muestra fecal se evaluó utilizando una transcripción inversa interna-PCR (RT-PCR) dirigida al gen M (3). Se sintetizó una biblioteca de cDNA utilizando SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y hexameros. La secuenciación completa del genoma de los productos PCR superpuestos se llevó a cabo en ambas direcciones, utilizando imprimadores originales y la secuenciación dideoxida de Sanger. Se realizaron reacciones secuenciales como se describió previamente (3). Se montaron secuencias y se anotó utilizando el software Geneious (versión 5.1.6). Obtuvimos una secuencia contando 30.847 nucleótidos. Los genes orf1ab, HE, S, ns5, E, M y N del BCoV obtenido fueron sometidos a un análisis de Blastn. De acuerdo con estos análisis, el gen orf1ab (20kb nucleótidos, localizado en el lado 5= del genoma) está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F cepa de los Emiratos Árabes Unidos (adhesión no KF906251), con una identidad nucleótida de 99,19%. Por el contrario, los genes NS2, HE, S, ns5, y M están estrechamente relacionados con la cepa BCoV Bubalus/Italia/179/07-11 (adhesión no EU019216), con identidades nucleótidas de 99,88, 99,45%, 99,02%, 98,79% El gen E está estrechamente relacionado con la cepa china del coronavirus bovino BCV-AKS-01 (adhesión no. KU886219), con una identidad de nucleótidos del 100%. Finalmente, se encontró la puntuación más alta de Blastn para el gen N con el BCoV-ENT entérico americano (adhesión no. AF391541), asociado con una identidad de nucleótidos del 100%. La alineación de múltiples secuencias, incluyendo 20 BCoV y 10 clado Un betacoronavirus estrechamente relacionado con BCoV de América del Norte, dos DcCoV de los Emiratos Árabes Unidos, y dos cepas del coronavirus humano OC43 (HCoV-OC43) de Francia, se realizó utilizando el algoritmo muscular implementado en MEGA7 (4, 5). El análisis filogenético sobre el orf1ab confirma que BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 está estrechamente relacionado con el coronavirus de camellos dromedario (DcCoV) HKU23-23-362F. El gen orf1ab de estos dos virus agrupados por separado de los virus de BCoV y BCoV similares a los de América del Norte y Asia. Este hallazgo también confirma los resultados de nuestro análisis previo sobre genomas parciales en los que los genes nsp12, S y N de BCoVs americanos y asiáticos se agrupan en un grupo llamado tentativamente C 1. Las regiones de codificación nsp12 y N de BCoVs de Francia y DcCoVs de los Emiratos Árabes Unidos agrupados en C 2. El gen DcCoV S individualizado a partir de ambos genes HCoV-OC43 y BCoV Los posibles eventos de recombinación podrían estar en el origen de DcCoV. Número(s) de adhesión. La secuencia completa de secuencia del genoma del aislado BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 ha sido depositada en GenBank bajo el número de adhesión KX982264.
|
¿Está el gen orf1ab en el extremo 3' o 5' del genoma del coronavirus bovino?
| false
| 921
|
{
"text": [
"5= side"
],
"answer_start": [
2067
]
}
|
5= lado
|
1,545
|
Características clínicas específicas de la infección por coronavirus humano entre adolescentes y adultos sanoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4a14Autores: Bouvier, Monique; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Fecha: 2018-02-02DOI: 10.11111/irv.12538Licencia: cc-byAbstract: El coronavirus humano (HCoV) es una causa conocida En un estudio multisite, observacional y longitudinal de ILI entre adolescentes y adultos sanos, el 12% de los sujetos fueron PCR positivos para HCoV. La distribución de especies fue la siguiente: HCoV-OC43 (34%), HCoV-229E (28%), HCoV-NL63 (22%) y HCoV-HKU1 (16%). No observamos diferencias específicas de especies en las características clínicas de la infección por HCoV, con la excepción de HCoV-HKU1, para la cual la gravedad de los síntomas gastrointestinales tendió más alta en el cuarto día de la enfermedad. Texto: Las manifestaciones clínicas de la infección por coronavirus humano (HCoV) van desde una enfermedad leve y autolimitante del tracto respiratorio superior a un síndrome de distrés respiratorio agudo con una alta tasa de mortalidad. Las especies altamente virulentas de HCoV fueron responsables de brotes de síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); las tasas de mortalidad de los casos oscilaron entre el 14% y el 45%. [1] [2] [3] Por el contrario, otras especies de HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E) son mucho más prevalentes, mucho menos graves, y causas comunes de enfermedad similar a la gripe (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Cinco estudios anteriores han descrito las características clínicas específicas de la infección por HCoV entre los adultos. 6, 7, [10] [11] [12] En dos de estos estudios, una proporción significativa de la población del estudio tenía condiciones médicas subyacentes. 6, 7 Describimos aquí, entre una cohorte de adolescentes sanos y adultos con enfermedad pseudogripal (ILI), la prevalencia específica de la especie y la gravedad de los síntomas asociados con la infección por HCoV. 13 Pacientes de 0 a 65 años de edad que presentaron atención < 72 horas después del inicio de los síntomas del ILI fueron reclutados para la participación en el estudio. ILI fue definido como una temperatura ≥100,4°F y dolor de garganta o uno de los siguientes síntomas respiratorios: tos, producción de esputo, falta de aliento o dolor torácico. Ambos pacientes internos y ambulatorios fueron elegibles para participar. Pacientes con condiciones médicas subyacentes (por ejemplo, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma grave), mujeres con un embarazo de alto riesgo o complicado, y pacientes con un trastorno psiquiátrico mal controlado fueron excluidos. A continuación, se instruyó a los participantes sobre el uso de un diario para registrar la presencia/severidad de los síntomas durante los 7 días siguientes a la aparición inicial de los síntomas. La gravedad de los síntomas se valoró en una escala ordinal de 0 (ninguna) a 3 (grave). Las puntuaciones de gravedad de los síntomas se cuantificaron utilizando las cinco medidas siguientes: i) puntuación individual de los síntomas para 20 síntomas, ii) puntuación de los síntomas respiratorios superiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para dolor de oído, secreción nasal, dolor de garganta y estornudos, iii) puntuación de los síntomas respiratorios inferiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para tos, dificultad para respirar, ronquera y molestias en el pecho, iv) puntuación de los síntomas gastrointestinales, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para diarrea, vómitos, anorexia, náuseas y (Tabla 1) Los hallazgos de nuestro estudio, realizado durante un período de 5 años en cinco sitios geográficamente dispersos en los EE.UU., demuestran que el coronavirus humano (HCoV) es una importante causa de enfermedad similar a la gripe (ILI) varió entre el 4% y el 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Además, encontramos que el HCoV-OC43to es la especie más común entre los adultos, como se ha informado en otros lugares. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 y HCoV-229E fueron las cepas más comunes en estaciones alternas, reflejando una variabilidad de temporada a temporada de la circulación de cepas de HCoV que se ha reportado en otros estudios plurianuales. 4 8 Los mecanismos por los cuales esta especie particular provoca estos síntomas no se conocen. Entre los puntos fuertes de este estudio de HCoV en adolescentes y adultos, de otra manera sanos, se encuentran su diseño multisitio y multianual, el uso de un panel diagnóstico multiplex, la recolección prospectiva de datos sintomáticos y el uso de una escala de severidad de síntomas similar a la empleada anteriormente. 15 Una limitación importante de este estudio fue nuestro reclutamiento selectivo de individuos que habían presentado a un centro de salud para el cuidado de un ILI. Por lo tanto, nuestros casos no son representativos de la infección por HCoV en la comunidad, donde los individuos con enfermedad leve y autolimitante debido a HCoV optan por no buscar atención médica para el manejo de su ILI. En resumen, hemos demostrado que el HCoV es una causa significativa de ILI entre adolescentes y adultos de otra forma saludables que se presentan para evaluación médica.
|
¿Cuál es una causa significativa de Influenze como enfermedad entre adolescentes sanos y adultos que se presentan para evaluación médica?
| false
| 1,658
|
{
"text": [
"HCoV"
],
"answer_start": [
5069
]
}
|
HCoV
|
1,545
|
Características clínicas específicas de la infección por coronavirus humano entre adolescentes y adultos sanoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4a14Autores: Bouvier, Monique; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Fecha: 2018-02-02DOI: 10.11111/irv.12538Licencia: cc-byAbstract: El coronavirus humano (HCoV) es una causa conocida En un estudio multisite, observacional y longitudinal de ILI entre adolescentes y adultos sanos, el 12% de los sujetos fueron PCR positivos para HCoV. La distribución de especies fue la siguiente: HCoV-OC43 (34%), HCoV-229E (28%), HCoV-NL63 (22%) y HCoV-HKU1 (16%). No observamos diferencias específicas de especies en las características clínicas de la infección por HCoV, con la excepción de HCoV-HKU1, para la cual la gravedad de los síntomas gastrointestinales tendió más alta en el cuarto día de la enfermedad. Texto: Las manifestaciones clínicas de la infección por coronavirus humano (HCoV) van desde una enfermedad leve y autolimitante del tracto respiratorio superior a un síndrome de distrés respiratorio agudo con una alta tasa de mortalidad. Las especies altamente virulentas de HCoV fueron responsables de brotes de síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); las tasas de mortalidad de los casos oscilaron entre el 14% y el 45%. [1] [2] [3] Por el contrario, otras especies de HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E) son mucho más prevalentes, mucho menos graves, y causas comunes de enfermedad similar a la gripe (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Cinco estudios anteriores han descrito las características clínicas específicas de la infección por HCoV entre los adultos. 6, 7, [10] [11] [12] En dos de estos estudios, una proporción significativa de la población del estudio tenía condiciones médicas subyacentes. 6, 7 Describimos aquí, entre una cohorte de adolescentes sanos y adultos con enfermedad pseudogripal (ILI), la prevalencia específica de la especie y la gravedad de los síntomas asociados con la infección por HCoV. 13 Pacientes de 0 a 65 años de edad que presentaron atención < 72 horas después del inicio de los síntomas del ILI fueron reclutados para la participación en el estudio. ILI fue definido como una temperatura ≥100,4°F y dolor de garganta o uno de los siguientes síntomas respiratorios: tos, producción de esputo, falta de aliento o dolor torácico. Ambos pacientes internos y ambulatorios fueron elegibles para participar. Pacientes con condiciones médicas subyacentes (por ejemplo, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma grave), mujeres con un embarazo de alto riesgo o complicado, y pacientes con un trastorno psiquiátrico mal controlado fueron excluidos. A continuación, se instruyó a los participantes sobre el uso de un diario para registrar la presencia/severidad de los síntomas durante los 7 días siguientes a la aparición inicial de los síntomas. La gravedad de los síntomas se valoró en una escala ordinal de 0 (ninguna) a 3 (grave). Las puntuaciones de gravedad de los síntomas se cuantificaron utilizando las cinco medidas siguientes: i) puntuación individual de los síntomas para 20 síntomas, ii) puntuación de los síntomas respiratorios superiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para dolor de oído, secreción nasal, dolor de garganta y estornudos, iii) puntuación de los síntomas respiratorios inferiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para tos, dificultad para respirar, ronquera y molestias en el pecho, iv) puntuación de los síntomas gastrointestinales, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para diarrea, vómitos, anorexia, náuseas y (Tabla 1) Los hallazgos de nuestro estudio, realizado durante un período de 5 años en cinco sitios geográficamente dispersos en los EE.UU., demuestran que el coronavirus humano (HCoV) es una importante causa de enfermedad similar a la gripe (ILI) varió entre el 4% y el 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Además, encontramos que el HCoV-OC43to es la especie más común entre los adultos, como se ha informado en otros lugares. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 y HCoV-229E fueron las cepas más comunes en estaciones alternas, reflejando una variabilidad de temporada a temporada de la circulación de cepas de HCoV que se ha reportado en otros estudios plurianuales. 4 8 Los mecanismos por los cuales esta especie particular provoca estos síntomas no se conocen. Entre los puntos fuertes de este estudio de HCoV en adolescentes y adultos, de otra manera sanos, se encuentran su diseño multisitio y multianual, el uso de un panel diagnóstico multiplex, la recolección prospectiva de datos sintomáticos y el uso de una escala de severidad de síntomas similar a la empleada anteriormente. 15 Una limitación importante de este estudio fue nuestro reclutamiento selectivo de individuos que habían presentado a un centro de salud para el cuidado de un ILI. Por lo tanto, nuestros casos no son representativos de la infección por HCoV en la comunidad, donde los individuos con enfermedad leve y autolimitante debido a HCoV optan por no buscar atención médica para el manejo de su ILI. En resumen, hemos demostrado que el HCoV es una causa significativa de ILI entre adolescentes y adultos de otra forma saludables que se presentan para evaluación médica.
|
¿Cuál es la especie más común del Coronavirus Humano entre los adultos?
| false
| 1,659
|
{
"text": [
"HCoV-OC43"
],
"answer_start": [
3997
]
}
|
HCoV-OC43
|
1,545
|
Características clínicas específicas de la infección por coronavirus humano entre adolescentes y adultos sanoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4a14Autores: Bouvier, Monique; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Fecha: 2018-02-02DOI: 10.11111/irv.12538Licencia: cc-byAbstract: El coronavirus humano (HCoV) es una causa conocida En un estudio multisite, observacional y longitudinal de ILI entre adolescentes y adultos sanos, el 12% de los sujetos fueron PCR positivos para HCoV. La distribución de especies fue la siguiente: HCoV-OC43 (34%), HCoV-229E (28%), HCoV-NL63 (22%) y HCoV-HKU1 (16%). No observamos diferencias específicas de especies en las características clínicas de la infección por HCoV, con la excepción de HCoV-HKU1, para la cual la gravedad de los síntomas gastrointestinales tendió más alta en el cuarto día de la enfermedad. Texto: Las manifestaciones clínicas de la infección por coronavirus humano (HCoV) van desde una enfermedad leve y autolimitante del tracto respiratorio superior a un síndrome de distrés respiratorio agudo con una alta tasa de mortalidad. Las especies altamente virulentas de HCoV fueron responsables de brotes de síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); las tasas de mortalidad de los casos oscilaron entre el 14% y el 45%. [1] [2] [3] Por el contrario, otras especies de HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E) son mucho más prevalentes, mucho menos graves, y causas comunes de enfermedad similar a la gripe (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Cinco estudios anteriores han descrito las características clínicas específicas de la infección por HCoV entre los adultos. 6, 7, [10] [11] [12] En dos de estos estudios, una proporción significativa de la población del estudio tenía condiciones médicas subyacentes. 6, 7 Describimos aquí, entre una cohorte de adolescentes sanos y adultos con enfermedad pseudogripal (ILI), la prevalencia específica de la especie y la gravedad de los síntomas asociados con la infección por HCoV. 13 Pacientes de 0 a 65 años de edad que presentaron atención < 72 horas después del inicio de los síntomas del ILI fueron reclutados para la participación en el estudio. ILI fue definido como una temperatura ≥100,4°F y dolor de garganta o uno de los siguientes síntomas respiratorios: tos, producción de esputo, falta de aliento o dolor torácico. Ambos pacientes internos y ambulatorios fueron elegibles para participar. Pacientes con condiciones médicas subyacentes (por ejemplo, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma grave), mujeres con un embarazo de alto riesgo o complicado, y pacientes con un trastorno psiquiátrico mal controlado fueron excluidos. A continuación, se instruyó a los participantes sobre el uso de un diario para registrar la presencia/severidad de los síntomas durante los 7 días siguientes a la aparición inicial de los síntomas. La gravedad de los síntomas se valoró en una escala ordinal de 0 (ninguna) a 3 (grave). Las puntuaciones de gravedad de los síntomas se cuantificaron utilizando las cinco medidas siguientes: i) puntuación individual de los síntomas para 20 síntomas, ii) puntuación de los síntomas respiratorios superiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para dolor de oído, secreción nasal, dolor de garganta y estornudos, iii) puntuación de los síntomas respiratorios inferiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para tos, dificultad para respirar, ronquera y molestias en el pecho, iv) puntuación de los síntomas gastrointestinales, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para diarrea, vómitos, anorexia, náuseas y (Tabla 1) Los hallazgos de nuestro estudio, realizado durante un período de 5 años en cinco sitios geográficamente dispersos en los EE.UU., demuestran que el coronavirus humano (HCoV) es una importante causa de enfermedad similar a la gripe (ILI) varió entre el 4% y el 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Además, encontramos que el HCoV-OC43to es la especie más común entre los adultos, como se ha informado en otros lugares. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 y HCoV-229E fueron las cepas más comunes en estaciones alternas, reflejando una variabilidad de temporada a temporada de la circulación de cepas de HCoV que se ha reportado en otros estudios plurianuales. 4 8 Los mecanismos por los cuales esta especie particular provoca estos síntomas no se conocen. Entre los puntos fuertes de este estudio de HCoV en adolescentes y adultos, de otra manera sanos, se encuentran su diseño multisitio y multianual, el uso de un panel diagnóstico multiplex, la recolección prospectiva de datos sintomáticos y el uso de una escala de severidad de síntomas similar a la empleada anteriormente. 15 Una limitación importante de este estudio fue nuestro reclutamiento selectivo de individuos que habían presentado a un centro de salud para el cuidado de un ILI. Por lo tanto, nuestros casos no son representativos de la infección por HCoV en la comunidad, donde los individuos con enfermedad leve y autolimitante debido a HCoV optan por no buscar atención médica para el manejo de su ILI. En resumen, hemos demostrado que el HCoV es una causa significativa de ILI entre adolescentes y adultos de otra forma saludables que se presentan para evaluación médica.
|
¿Qué Coronavirus humano mostró características clínicas específicas de su infección?
| false
| 1,660
|
{
"text": [
"HCoV‐HKU1"
],
"answer_start": [
956
]
}
|
HCoV-HKU1
|
1,545
|
Características clínicas específicas de la infección por coronavirus humano entre adolescentes y adultos sanoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4a14Autores: Bouvier, Monique; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Fecha: 2018-02-02DOI: 10.11111/irv.12538Licencia: cc-byAbstract: El coronavirus humano (HCoV) es una causa conocida En un estudio multisite, observacional y longitudinal de ILI entre adolescentes y adultos sanos, el 12% de los sujetos fueron PCR positivos para HCoV. La distribución de especies fue la siguiente: HCoV-OC43 (34%), HCoV-229E (28%), HCoV-NL63 (22%) y HCoV-HKU1 (16%). No observamos diferencias específicas de especies en las características clínicas de la infección por HCoV, con la excepción de HCoV-HKU1, para la cual la gravedad de los síntomas gastrointestinales tendió más alta en el cuarto día de la enfermedad. Texto: Las manifestaciones clínicas de la infección por coronavirus humano (HCoV) van desde una enfermedad leve y autolimitante del tracto respiratorio superior a un síndrome de distrés respiratorio agudo con una alta tasa de mortalidad. Las especies altamente virulentas de HCoV fueron responsables de brotes de síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); las tasas de mortalidad de los casos oscilaron entre el 14% y el 45%. [1] [2] [3] Por el contrario, otras especies de HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E) son mucho más prevalentes, mucho menos graves, y causas comunes de enfermedad similar a la gripe (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Cinco estudios anteriores han descrito las características clínicas específicas de la infección por HCoV entre los adultos. 6, 7, [10] [11] [12] En dos de estos estudios, una proporción significativa de la población del estudio tenía condiciones médicas subyacentes. 6, 7 Describimos aquí, entre una cohorte de adolescentes sanos y adultos con enfermedad pseudogripal (ILI), la prevalencia específica de la especie y la gravedad de los síntomas asociados con la infección por HCoV. 13 Pacientes de 0 a 65 años de edad que presentaron atención < 72 horas después del inicio de los síntomas del ILI fueron reclutados para la participación en el estudio. ILI fue definido como una temperatura ≥100,4°F y dolor de garganta o uno de los siguientes síntomas respiratorios: tos, producción de esputo, falta de aliento o dolor torácico. Ambos pacientes internos y ambulatorios fueron elegibles para participar. Pacientes con condiciones médicas subyacentes (por ejemplo, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma grave), mujeres con un embarazo de alto riesgo o complicado, y pacientes con un trastorno psiquiátrico mal controlado fueron excluidos. A continuación, se instruyó a los participantes sobre el uso de un diario para registrar la presencia/severidad de los síntomas durante los 7 días siguientes a la aparición inicial de los síntomas. La gravedad de los síntomas se valoró en una escala ordinal de 0 (ninguna) a 3 (grave). Las puntuaciones de gravedad de los síntomas se cuantificaron utilizando las cinco medidas siguientes: i) puntuación individual de los síntomas para 20 síntomas, ii) puntuación de los síntomas respiratorios superiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para dolor de oído, secreción nasal, dolor de garganta y estornudos, iii) puntuación de los síntomas respiratorios inferiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para tos, dificultad para respirar, ronquera y molestias en el pecho, iv) puntuación de los síntomas gastrointestinales, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para diarrea, vómitos, anorexia, náuseas y (Tabla 1) Los hallazgos de nuestro estudio, realizado durante un período de 5 años en cinco sitios geográficamente dispersos en los EE.UU., demuestran que el coronavirus humano (HCoV) es una importante causa de enfermedad similar a la gripe (ILI) varió entre el 4% y el 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Además, encontramos que el HCoV-OC43to es la especie más común entre los adultos, como se ha informado en otros lugares. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 y HCoV-229E fueron las cepas más comunes en estaciones alternas, reflejando una variabilidad de temporada a temporada de la circulación de cepas de HCoV que se ha reportado en otros estudios plurianuales. 4 8 Los mecanismos por los cuales esta especie particular provoca estos síntomas no se conocen. Entre los puntos fuertes de este estudio de HCoV en adolescentes y adultos, de otra manera sanos, se encuentran su diseño multisitio y multianual, el uso de un panel diagnóstico multiplex, la recolección prospectiva de datos sintomáticos y el uso de una escala de severidad de síntomas similar a la empleada anteriormente. 15 Una limitación importante de este estudio fue nuestro reclutamiento selectivo de individuos que habían presentado a un centro de salud para el cuidado de un ILI. Por lo tanto, nuestros casos no son representativos de la infección por HCoV en la comunidad, donde los individuos con enfermedad leve y autolimitante debido a HCoV optan por no buscar atención médica para el manejo de su ILI. En resumen, hemos demostrado que el HCoV es una causa significativa de ILI entre adolescentes y adultos de otra forma saludables que se presentan para evaluación médica.
|
¿Qué causa el brote de SARS y MERS.
| false
| 1,717
|
{
"text": [
"Highly virulent species of HCoV"
],
"answer_start": [
1276
]
}
|
Especies altamente virulentas de HCoV
|
1,545
|
Características clínicas específicas de la infección por coronavirus humano entre adolescentes y adultos sanoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4a14Autores: Bouvier, Monique; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Fecha: 2018-02-02DOI: 10.11111/irv.12538Licencia: cc-byAbstract: El coronavirus humano (HCoV) es una causa conocida En un estudio multisite, observacional y longitudinal de ILI entre adolescentes y adultos sanos, el 12% de los sujetos fueron PCR positivos para HCoV. La distribución de especies fue la siguiente: HCoV-OC43 (34%), HCoV-229E (28%), HCoV-NL63 (22%) y HCoV-HKU1 (16%). No observamos diferencias específicas de especies en las características clínicas de la infección por HCoV, con la excepción de HCoV-HKU1, para la cual la gravedad de los síntomas gastrointestinales tendió más alta en el cuarto día de la enfermedad. Texto: Las manifestaciones clínicas de la infección por coronavirus humano (HCoV) van desde una enfermedad leve y autolimitante del tracto respiratorio superior a un síndrome de distrés respiratorio agudo con una alta tasa de mortalidad. Las especies altamente virulentas de HCoV fueron responsables de brotes de síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); las tasas de mortalidad de los casos oscilaron entre el 14% y el 45%. [1] [2] [3] Por el contrario, otras especies de HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E) son mucho más prevalentes, mucho menos graves, y causas comunes de enfermedad similar a la gripe (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Cinco estudios anteriores han descrito las características clínicas específicas de la infección por HCoV entre los adultos. 6, 7, [10] [11] [12] En dos de estos estudios, una proporción significativa de la población del estudio tenía condiciones médicas subyacentes. 6, 7 Describimos aquí, entre una cohorte de adolescentes sanos y adultos con enfermedad pseudogripal (ILI), la prevalencia específica de la especie y la gravedad de los síntomas asociados con la infección por HCoV. 13 Pacientes de 0 a 65 años de edad que presentaron atención < 72 horas después del inicio de los síntomas del ILI fueron reclutados para la participación en el estudio. ILI fue definido como una temperatura ≥100,4°F y dolor de garganta o uno de los siguientes síntomas respiratorios: tos, producción de esputo, falta de aliento o dolor torácico. Ambos pacientes internos y ambulatorios fueron elegibles para participar. Pacientes con condiciones médicas subyacentes (por ejemplo, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma grave), mujeres con un embarazo de alto riesgo o complicado, y pacientes con un trastorno psiquiátrico mal controlado fueron excluidos. A continuación, se instruyó a los participantes sobre el uso de un diario para registrar la presencia/severidad de los síntomas durante los 7 días siguientes a la aparición inicial de los síntomas. La gravedad de los síntomas se valoró en una escala ordinal de 0 (ninguna) a 3 (grave). Las puntuaciones de gravedad de los síntomas se cuantificaron utilizando las cinco medidas siguientes: i) puntuación individual de los síntomas para 20 síntomas, ii) puntuación de los síntomas respiratorios superiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para dolor de oído, secreción nasal, dolor de garganta y estornudos, iii) puntuación de los síntomas respiratorios inferiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para tos, dificultad para respirar, ronquera y molestias en el pecho, iv) puntuación de los síntomas gastrointestinales, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para diarrea, vómitos, anorexia, náuseas y (Tabla 1) Los hallazgos de nuestro estudio, realizado durante un período de 5 años en cinco sitios geográficamente dispersos en los EE.UU., demuestran que el coronavirus humano (HCoV) es una importante causa de enfermedad similar a la gripe (ILI) varió entre el 4% y el 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Además, encontramos que el HCoV-OC43to es la especie más común entre los adultos, como se ha informado en otros lugares. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 y HCoV-229E fueron las cepas más comunes en estaciones alternas, reflejando una variabilidad de temporada a temporada de la circulación de cepas de HCoV que se ha reportado en otros estudios plurianuales. 4 8 Los mecanismos por los cuales esta especie particular provoca estos síntomas no se conocen. Entre los puntos fuertes de este estudio de HCoV en adolescentes y adultos, de otra manera sanos, se encuentran su diseño multisitio y multianual, el uso de un panel diagnóstico multiplex, la recolección prospectiva de datos sintomáticos y el uso de una escala de severidad de síntomas similar a la empleada anteriormente. 15 Una limitación importante de este estudio fue nuestro reclutamiento selectivo de individuos que habían presentado a un centro de salud para el cuidado de un ILI. Por lo tanto, nuestros casos no son representativos de la infección por HCoV en la comunidad, donde los individuos con enfermedad leve y autolimitante debido a HCoV optan por no buscar atención médica para el manejo de su ILI. En resumen, hemos demostrado que el HCoV es una causa significativa de ILI entre adolescentes y adultos de otra forma saludables que se presentan para evaluación médica.
|
¿Cuál es la tasa de mortalidad de SARS y MERS?
| false
| 1,718
|
{
"text": [
"ranged from 14% to 45%"
],
"answer_start": [
1448
]
}
|
osciló entre el 14% y el 45%
|
1,545
|
Características clínicas específicas de la infección por coronavirus humano entre adolescentes y adultos sanoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4a14Autores: Bouvier, Monique; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Fecha: 2018-02-02DOI: 10.11111/irv.12538Licencia: cc-byAbstract: El coronavirus humano (HCoV) es una causa conocida En un estudio multisite, observacional y longitudinal de ILI entre adolescentes y adultos sanos, el 12% de los sujetos fueron PCR positivos para HCoV. La distribución de especies fue la siguiente: HCoV-OC43 (34%), HCoV-229E (28%), HCoV-NL63 (22%) y HCoV-HKU1 (16%). No observamos diferencias específicas de especies en las características clínicas de la infección por HCoV, con la excepción de HCoV-HKU1, para la cual la gravedad de los síntomas gastrointestinales tendió más alta en el cuarto día de la enfermedad. Texto: Las manifestaciones clínicas de la infección por coronavirus humano (HCoV) van desde una enfermedad leve y autolimitante del tracto respiratorio superior a un síndrome de distrés respiratorio agudo con una alta tasa de mortalidad. Las especies altamente virulentas de HCoV fueron responsables de brotes de síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); las tasas de mortalidad de los casos oscilaron entre el 14% y el 45%. [1] [2] [3] Por el contrario, otras especies de HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E) son mucho más prevalentes, mucho menos graves, y causas comunes de enfermedad similar a la gripe (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Cinco estudios anteriores han descrito las características clínicas específicas de la infección por HCoV entre los adultos. 6, 7, [10] [11] [12] En dos de estos estudios, una proporción significativa de la población del estudio tenía condiciones médicas subyacentes. 6, 7 Describimos aquí, entre una cohorte de adolescentes sanos y adultos con enfermedad pseudogripal (ILI), la prevalencia específica de la especie y la gravedad de los síntomas asociados con la infección por HCoV. 13 Pacientes de 0 a 65 años de edad que presentaron atención < 72 horas después del inicio de los síntomas del ILI fueron reclutados para la participación en el estudio. ILI fue definido como una temperatura ≥100,4°F y dolor de garganta o uno de los siguientes síntomas respiratorios: tos, producción de esputo, falta de aliento o dolor torácico. Ambos pacientes internos y ambulatorios fueron elegibles para participar. Pacientes con condiciones médicas subyacentes (por ejemplo, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma grave), mujeres con un embarazo de alto riesgo o complicado, y pacientes con un trastorno psiquiátrico mal controlado fueron excluidos. A continuación, se instruyó a los participantes sobre el uso de un diario para registrar la presencia/severidad de los síntomas durante los 7 días siguientes a la aparición inicial de los síntomas. La gravedad de los síntomas se valoró en una escala ordinal de 0 (ninguna) a 3 (grave). Las puntuaciones de gravedad de los síntomas se cuantificaron utilizando las cinco medidas siguientes: i) puntuación individual de los síntomas para 20 síntomas, ii) puntuación de los síntomas respiratorios superiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para dolor de oído, secreción nasal, dolor de garganta y estornudos, iii) puntuación de los síntomas respiratorios inferiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para tos, dificultad para respirar, ronquera y molestias en el pecho, iv) puntuación de los síntomas gastrointestinales, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para diarrea, vómitos, anorexia, náuseas y (Tabla 1) Los hallazgos de nuestro estudio, realizado durante un período de 5 años en cinco sitios geográficamente dispersos en los EE.UU., demuestran que el coronavirus humano (HCoV) es una importante causa de enfermedad similar a la gripe (ILI) varió entre el 4% y el 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Además, encontramos que el HCoV-OC43to es la especie más común entre los adultos, como se ha informado en otros lugares. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 y HCoV-229E fueron las cepas más comunes en estaciones alternas, reflejando una variabilidad de temporada a temporada de la circulación de cepas de HCoV que se ha reportado en otros estudios plurianuales. 4 8 Los mecanismos por los cuales esta especie particular provoca estos síntomas no se conocen. Entre los puntos fuertes de este estudio de HCoV en adolescentes y adultos, de otra manera sanos, se encuentran su diseño multisitio y multianual, el uso de un panel diagnóstico multiplex, la recolección prospectiva de datos sintomáticos y el uso de una escala de severidad de síntomas similar a la empleada anteriormente. 15 Una limitación importante de este estudio fue nuestro reclutamiento selectivo de individuos que habían presentado a un centro de salud para el cuidado de un ILI. Por lo tanto, nuestros casos no son representativos de la infección por HCoV en la comunidad, donde los individuos con enfermedad leve y autolimitante debido a HCoV optan por no buscar atención médica para el manejo de su ILI. En resumen, hemos demostrado que el HCoV es una causa significativa de ILI entre adolescentes y adultos de otra forma saludables que se presentan para evaluación médica.
|
¿Cuáles fueron las cepas comunes de HCOV en el estudio de 5 años en EE.UU.?
| false
| 1,719
|
{
"text": [
"HCoV-OC43 and HCoV-229E"
],
"answer_start": [
4100
]
}
|
HCoV-OC43 y HCoV-229E
|
1,545
|
Características clínicas específicas de la infección por coronavirus humano entre adolescentes y adultos sanoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4a14Autores: Bouvier, Monique; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Fecha: 2018-02-02DOI: 10.11111/irv.12538Licencia: cc-byAbstract: El coronavirus humano (HCoV) es una causa conocida En un estudio multisite, observacional y longitudinal de ILI entre adolescentes y adultos sanos, el 12% de los sujetos fueron PCR positivos para HCoV. La distribución de especies fue la siguiente: HCoV-OC43 (34%), HCoV-229E (28%), HCoV-NL63 (22%) y HCoV-HKU1 (16%). No observamos diferencias específicas de especies en las características clínicas de la infección por HCoV, con la excepción de HCoV-HKU1, para la cual la gravedad de los síntomas gastrointestinales tendió más alta en el cuarto día de la enfermedad. Texto: Las manifestaciones clínicas de la infección por coronavirus humano (HCoV) van desde una enfermedad leve y autolimitante del tracto respiratorio superior a un síndrome de distrés respiratorio agudo con una alta tasa de mortalidad. Las especies altamente virulentas de HCoV fueron responsables de brotes de síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); las tasas de mortalidad de los casos oscilaron entre el 14% y el 45%. [1] [2] [3] Por el contrario, otras especies de HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E) son mucho más prevalentes, mucho menos graves, y causas comunes de enfermedad similar a la gripe (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Cinco estudios anteriores han descrito las características clínicas específicas de la infección por HCoV entre los adultos. 6, 7, [10] [11] [12] En dos de estos estudios, una proporción significativa de la población del estudio tenía condiciones médicas subyacentes. 6, 7 Describimos aquí, entre una cohorte de adolescentes sanos y adultos con enfermedad pseudogripal (ILI), la prevalencia específica de la especie y la gravedad de los síntomas asociados con la infección por HCoV. 13 Pacientes de 0 a 65 años de edad que presentaron atención < 72 horas después del inicio de los síntomas del ILI fueron reclutados para la participación en el estudio. ILI fue definido como una temperatura ≥100,4°F y dolor de garganta o uno de los siguientes síntomas respiratorios: tos, producción de esputo, falta de aliento o dolor torácico. Ambos pacientes internos y ambulatorios fueron elegibles para participar. Pacientes con condiciones médicas subyacentes (por ejemplo, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma grave), mujeres con un embarazo de alto riesgo o complicado, y pacientes con un trastorno psiquiátrico mal controlado fueron excluidos. A continuación, se instruyó a los participantes sobre el uso de un diario para registrar la presencia/severidad de los síntomas durante los 7 días siguientes a la aparición inicial de los síntomas. La gravedad de los síntomas se valoró en una escala ordinal de 0 (ninguna) a 3 (grave). Las puntuaciones de gravedad de los síntomas se cuantificaron utilizando las cinco medidas siguientes: i) puntuación individual de los síntomas para 20 síntomas, ii) puntuación de los síntomas respiratorios superiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para dolor de oído, secreción nasal, dolor de garganta y estornudos, iii) puntuación de los síntomas respiratorios inferiores, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para tos, dificultad para respirar, ronquera y molestias en el pecho, iv) puntuación de los síntomas gastrointestinales, calculada como la suma de las puntuaciones de gravedad para diarrea, vómitos, anorexia, náuseas y (Tabla 1) Los hallazgos de nuestro estudio, realizado durante un período de 5 años en cinco sitios geográficamente dispersos en los EE.UU., demuestran que el coronavirus humano (HCoV) es una importante causa de enfermedad similar a la gripe (ILI) varió entre el 4% y el 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Además, encontramos que el HCoV-OC43to es la especie más común entre los adultos, como se ha informado en otros lugares. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 y HCoV-229E fueron las cepas más comunes en estaciones alternas, reflejando una variabilidad de temporada a temporada de la circulación de cepas de HCoV que se ha reportado en otros estudios plurianuales. 4 8 Los mecanismos por los cuales esta especie particular provoca estos síntomas no se conocen. Entre los puntos fuertes de este estudio de HCoV en adolescentes y adultos, de otra manera sanos, se encuentran su diseño multisitio y multianual, el uso de un panel diagnóstico multiplex, la recolección prospectiva de datos sintomáticos y el uso de una escala de severidad de síntomas similar a la empleada anteriormente. 15 Una limitación importante de este estudio fue nuestro reclutamiento selectivo de individuos que habían presentado a un centro de salud para el cuidado de un ILI. Por lo tanto, nuestros casos no son representativos de la infección por HCoV en la comunidad, donde los individuos con enfermedad leve y autolimitante debido a HCoV optan por no buscar atención médica para el manejo de su ILI. En resumen, hemos demostrado que el HCoV es una causa significativa de ILI entre adolescentes y adultos de otra forma saludables que se presentan para evaluación médica.
|
¿Qué especies son más prevalentes pero menos severas?
| false
| 1,720
|
{
"text": [
"HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63, and HCoV-229E"
],
"answer_start": [
1517
]
}
|
HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 y HCoV-229E
|
1,552
|
Un paso más cerca de un sistema de infección experimental para el virus de la hepatitis B? --- la identificación del péptido cotransportador de taurocolato de sodio como receptor viralhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3562259/SHA: f4f36a8e9fee64d59ccf22b724c7dab345102658Autores: Chen, Pei-Jer; Wu, T-CFecha: 2013-01-11DOI: 10.1186/2045-3701-3-2Licencia: cc-byAbstract: Tras la clonación exitosa del receptor para el coronavirus del SARS hace unos años, el Dr. Wenhui Li y sus colegas volvieron a llamar la atención publicando un posible receptor para el virus de la hepatitis B en eLife. Revisaremos brevemente Texto: Entre los cinco virus hepatotrópicos de la hepatitis, sólo el virus de la hepatitis B (VHB) y su virus satélite de la hepatitis D (VHD) todavía esperan el desarrollo de un sistema de infección in vitro en el cultivo celular. Una línea celular de carcinoma hepatocelular (HCC), HepaRG, puede infectarse con una eficiencia modesta después de semanas de cultivo y diferenciación inducida [1]. Incluso los hepatocitos humanos primarios pierden rápidamente la capacidad de infección por el VHB después de un breve cultivo celular. La infección por el VHB exige factores tanto intracelulares como de superficie celular. Los requisitos intracelulares parecen menos estrictos, ya que después de la transfección del ADN del VHB en muchas líneas celulares del HCC o hígado de ratón, que no pueden infectarse naturalmente, el genoma viral se expresa y replica activamente. Así, el fracaso de la infección por el VHB se considera en gran parte debido a Las moléculas de la membrana celular necesarias para la infección por VHB pueden dividirse en dos clases: baja afinidad y alta afinidad. Entre otras, los sulfatos de heparano en las proteínas de la membrana median la interacción amplia, pero menos específica, de células víricas. Sin embargo, los socios de membrana de alta afinidad para el VHB siguen siendo elusivos (la carboxipeptidasa D encontrada para el virus de la hepatitis B del pato puede ser el único contendiente grave [2] ). La proteína de envoltura del VHB, a saber, los antígenos de superficie, desempeña un papel esencial en el proceso de infección. Ambos exámenes genéticos y funcionales identificaron un dominio en el Nterminus del VHB preS1 (aminoácidos 1-47) necesario para la infección. Se ha demostrado que este dominio funciona como mediador directo para el VHB mediante la unión de receptores (s) Más importante aún, el péptido miristoilado se muestra para bloquear efectivamente la infección del VHB en los hepatocitos humanos primarios y en el ratón hepatocytechimera humano en una concentración nanomolar [4]. De hecho, un ensayo clínico que prueba la eficacia de este péptido en la prevención de la infección del VHB ha estado en curso [5]. Claramente, este péptido preS1 puede ser una sonda útil para extraer los factores celulares que interactúan, incluyendo receptores virales específicos. Yan et al. han tomado un enfoque razonable para pescar posibles receptores del VHB [6]. Ellos diseñaron el primer 2-47 péptido aminoácido de PreS1 para aumentar su capacidad para ser interconectado con proteínas que interactúan con la membrana celular, sin afectar a su especificidad de unión. Las estrategias realmente bajaron muchas proteínas de membrana, pero en comparación con el control negativo (péptido homológico sin unión específica), identificaron una proteína celular, NTCP (péptido de cotransporte de taurocolato sódico) por LC/MS/MS. La misma proteína también fue retirada de los hepatocitos humanos. Los autores produjeron líneas celulares de HCC que expresaban fuertemente NTCP y posteriormente las infectaron con HBV o HDV. La tinción de inmunofluorescencia demostró claramente la expresión de proteínas de HBV y HDV en estas líneas celulares, lo que sugiere una infección viral exitosa. Además, documentaron un aumento de 2-4 veces del ARN viral y ADN después de la infección en la línea celular por PCR en tiempo real. También mostraron una mancha sureña que apoya la presencia de ADN circular covalentemente cerrado de HBV en la célula infectada, un marcador bien reconocido para la infección Finalmente, identificaron un tramo de 10 aminoácidos en el dominio de la transmembrana NTCP, como el motivo que interactúa directamente con el péptido PreS1. NTCP es una proteína transmembrana, usualmente localizada en la superficie lateral (canalicular) de los hepatocitos, que media el transporte de ácido biliar [7]. Geográficamente, es un buen candidato para un receptor de VHB. Además, los autores podrían convertir las líneas celulares previamente no permisibles a la infección por VHB a permitidas por sobreexpresión de PCN, apoyando de nuevo su posible papel en el proceso de infección por VHB. Esto puede ser un descubrimiento crítico y esperado hacia la comprensión de los receptores de VHB y el establecimiento de un sistema experimental de infección por VHB. Mirando hacia adelante, necesitamos entender cómo el PCN interactúa con ambas proteínas de envoltura de VHB y con otras proteínas celulares, especialmente a través El NTCP en sí mismo no es suficiente para permitir la infección por VHB, ya que la mayoría de las células de HepaRG fueron encontradas para expresar el NPCT pero no para ser infectadas [8]. El NTCP podría iniciar o mediar interacciones moleculares que pueden superar las restricciones de la superficie celular para la entrada viral. Tales factores celulares o virales cooperativos deben ser descubiertos y demostrados para mejorar la eficiencia de la infección viral, a un nivel comparable a uno natural (cientos o miles de amplificación viral). Por ejemplo, los autores pueden utilizar las líneas celulares que expresan el NTCP como los materiales iniciales para identificar sistémicamente otros factores (tal vez carboxipeptidasa D) y hacer que estas líneas celulares sean más productivas y permisivas a la infección por VHB. En un futuro próximo, se espera que los ensayos virológicos estándar para las infecciones por VHB, incluyendo manchas del norte u oeste, La comunidad de investigación del VHB ha buscado receptores del VHB durante décadas. Muchos candidatos han sido descubiertos y luego descartados. El estudio actual, sin embargo, aprovechó un péptido viral bien documentado requerido para la entrada del VHB en combinación con una plataforma proteómica de última generación. Como dice un proverbio chino, "un viaje de mil millas comienza desde un paso gradual". Así, la identificación del NTCP como receptor viral potencial del VHB puede servir como un paso inicial importante para este viaje, llevando al desarrollo de un sistema de infección del VHB para facilitar la investigación del VHB y el tratamiento de la hepatitis B.
|
¿Qué se requiere para una infección por hepatitis B en las células?
| false
| 2,996
|
{
"text": [
"both intracellular and cell-surface factors"
],
"answer_start": [
1158
]
}
|
factores intracelulares y de la superficie celular
|
1,552
|
Un paso más cerca de un sistema de infección experimental para el virus de la hepatitis B? --- la identificación del péptido cotransportador de taurocolato de sodio como receptor viralhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3562259/SHA: f4f36a8e9fee64d59ccf22b724c7dab345102658Autores: Chen, Pei-Jer; Wu, T-CFecha: 2013-01-11DOI: 10.1186/2045-3701-3-2Licencia: cc-byAbstract: Tras la clonación exitosa del receptor para el coronavirus del SARS hace unos años, el Dr. Wenhui Li y sus colegas volvieron a llamar la atención publicando un posible receptor para el virus de la hepatitis B en eLife. Revisaremos brevemente Texto: Entre los cinco virus hepatotrópicos de la hepatitis, sólo el virus de la hepatitis B (VHB) y su virus satélite de la hepatitis D (VHD) todavía esperan el desarrollo de un sistema de infección in vitro en el cultivo celular. Una línea celular de carcinoma hepatocelular (HCC), HepaRG, puede infectarse con una eficiencia modesta después de semanas de cultivo y diferenciación inducida [1]. Incluso los hepatocitos humanos primarios pierden rápidamente la capacidad de infección por el VHB después de un breve cultivo celular. La infección por el VHB exige factores tanto intracelulares como de superficie celular. Los requisitos intracelulares parecen menos estrictos, ya que después de la transfección del ADN del VHB en muchas líneas celulares del HCC o hígado de ratón, que no pueden infectarse naturalmente, el genoma viral se expresa y replica activamente. Así, el fracaso de la infección por el VHB se considera en gran parte debido a Las moléculas de la membrana celular necesarias para la infección por VHB pueden dividirse en dos clases: baja afinidad y alta afinidad. Entre otras, los sulfatos de heparano en las proteínas de la membrana median la interacción amplia, pero menos específica, de células víricas. Sin embargo, los socios de membrana de alta afinidad para el VHB siguen siendo elusivos (la carboxipeptidasa D encontrada para el virus de la hepatitis B del pato puede ser el único contendiente grave [2] ). La proteína de envoltura del VHB, a saber, los antígenos de superficie, desempeña un papel esencial en el proceso de infección. Ambos exámenes genéticos y funcionales identificaron un dominio en el Nterminus del VHB preS1 (aminoácidos 1-47) necesario para la infección. Se ha demostrado que este dominio funciona como mediador directo para el VHB mediante la unión de receptores (s) Más importante aún, el péptido miristoilado se muestra para bloquear efectivamente la infección del VHB en los hepatocitos humanos primarios y en el ratón hepatocytechimera humano en una concentración nanomolar [4]. De hecho, un ensayo clínico que prueba la eficacia de este péptido en la prevención de la infección del VHB ha estado en curso [5]. Claramente, este péptido preS1 puede ser una sonda útil para extraer los factores celulares que interactúan, incluyendo receptores virales específicos. Yan et al. han tomado un enfoque razonable para pescar posibles receptores del VHB [6]. Ellos diseñaron el primer 2-47 péptido aminoácido de PreS1 para aumentar su capacidad para ser interconectado con proteínas que interactúan con la membrana celular, sin afectar a su especificidad de unión. Las estrategias realmente bajaron muchas proteínas de membrana, pero en comparación con el control negativo (péptido homológico sin unión específica), identificaron una proteína celular, NTCP (péptido de cotransporte de taurocolato sódico) por LC/MS/MS. La misma proteína también fue retirada de los hepatocitos humanos. Los autores produjeron líneas celulares de HCC que expresaban fuertemente NTCP y posteriormente las infectaron con HBV o HDV. La tinción de inmunofluorescencia demostró claramente la expresión de proteínas de HBV y HDV en estas líneas celulares, lo que sugiere una infección viral exitosa. Además, documentaron un aumento de 2-4 veces del ARN viral y ADN después de la infección en la línea celular por PCR en tiempo real. También mostraron una mancha sureña que apoya la presencia de ADN circular covalentemente cerrado de HBV en la célula infectada, un marcador bien reconocido para la infección Finalmente, identificaron un tramo de 10 aminoácidos en el dominio de la transmembrana NTCP, como el motivo que interactúa directamente con el péptido PreS1. NTCP es una proteína transmembrana, usualmente localizada en la superficie lateral (canalicular) de los hepatocitos, que media el transporte de ácido biliar [7]. Geográficamente, es un buen candidato para un receptor de VHB. Además, los autores podrían convertir las líneas celulares previamente no permisibles a la infección por VHB a permitidas por sobreexpresión de PCN, apoyando de nuevo su posible papel en el proceso de infección por VHB. Esto puede ser un descubrimiento crítico y esperado hacia la comprensión de los receptores de VHB y el establecimiento de un sistema experimental de infección por VHB. Mirando hacia adelante, necesitamos entender cómo el PCN interactúa con ambas proteínas de envoltura de VHB y con otras proteínas celulares, especialmente a través El NTCP en sí mismo no es suficiente para permitir la infección por VHB, ya que la mayoría de las células de HepaRG fueron encontradas para expresar el NPCT pero no para ser infectadas [8]. El NTCP podría iniciar o mediar interacciones moleculares que pueden superar las restricciones de la superficie celular para la entrada viral. Tales factores celulares o virales cooperativos deben ser descubiertos y demostrados para mejorar la eficiencia de la infección viral, a un nivel comparable a uno natural (cientos o miles de amplificación viral). Por ejemplo, los autores pueden utilizar las líneas celulares que expresan el NTCP como los materiales iniciales para identificar sistémicamente otros factores (tal vez carboxipeptidasa D) y hacer que estas líneas celulares sean más productivas y permisivas a la infección por VHB. En un futuro próximo, se espera que los ensayos virológicos estándar para las infecciones por VHB, incluyendo manchas del norte u oeste, La comunidad de investigación del VHB ha buscado receptores del VHB durante décadas. Muchos candidatos han sido descubiertos y luego descartados. El estudio actual, sin embargo, aprovechó un péptido viral bien documentado requerido para la entrada del VHB en combinación con una plataforma proteómica de última generación. Como dice un proverbio chino, "un viaje de mil millas comienza desde un paso gradual". Así, la identificación del NTCP como receptor viral potencial del VHB puede servir como un paso inicial importante para este viaje, llevando al desarrollo de un sistema de infección del VHB para facilitar la investigación del VHB y el tratamiento de la hepatitis B.
|
¿Qué regula la amplia, pero menos específica, interacción virus-células en una infección por hepatitis B?
| false
| 2,997
|
{
"text": [
"heparan sulfates in the membrane proteins"
],
"answer_start": [
1727
]
}
|
sulfatos de heparano en las proteínas de la membrana
|
1,552
|
Un paso más cerca de un sistema de infección experimental para el virus de la hepatitis B? --- la identificación del péptido cotransportador de taurocolato de sodio como receptor viralhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3562259/SHA: f4f36a8e9fee64d59ccf22b724c7dab345102658Autores: Chen, Pei-Jer; Wu, T-CFecha: 2013-01-11DOI: 10.1186/2045-3701-3-2Licencia: cc-byAbstract: Tras la clonación exitosa del receptor para el coronavirus del SARS hace unos años, el Dr. Wenhui Li y sus colegas volvieron a llamar la atención publicando un posible receptor para el virus de la hepatitis B en eLife. Revisaremos brevemente Texto: Entre los cinco virus hepatotrópicos de la hepatitis, sólo el virus de la hepatitis B (VHB) y su virus satélite de la hepatitis D (VHD) todavía esperan el desarrollo de un sistema de infección in vitro en el cultivo celular. Una línea celular de carcinoma hepatocelular (HCC), HepaRG, puede infectarse con una eficiencia modesta después de semanas de cultivo y diferenciación inducida [1]. Incluso los hepatocitos humanos primarios pierden rápidamente la capacidad de infección por el VHB después de un breve cultivo celular. La infección por el VHB exige factores tanto intracelulares como de superficie celular. Los requisitos intracelulares parecen menos estrictos, ya que después de la transfección del ADN del VHB en muchas líneas celulares del HCC o hígado de ratón, que no pueden infectarse naturalmente, el genoma viral se expresa y replica activamente. Así, el fracaso de la infección por el VHB se considera en gran parte debido a Las moléculas de la membrana celular necesarias para la infección por VHB pueden dividirse en dos clases: baja afinidad y alta afinidad. Entre otras, los sulfatos de heparano en las proteínas de la membrana median la interacción amplia, pero menos específica, de células víricas. Sin embargo, los socios de membrana de alta afinidad para el VHB siguen siendo elusivos (la carboxipeptidasa D encontrada para el virus de la hepatitis B del pato puede ser el único contendiente grave [2] ). La proteína de envoltura del VHB, a saber, los antígenos de superficie, desempeña un papel esencial en el proceso de infección. Ambos exámenes genéticos y funcionales identificaron un dominio en el Nterminus del VHB preS1 (aminoácidos 1-47) necesario para la infección. Se ha demostrado que este dominio funciona como mediador directo para el VHB mediante la unión de receptores (s) Más importante aún, el péptido miristoilado se muestra para bloquear efectivamente la infección del VHB en los hepatocitos humanos primarios y en el ratón hepatocytechimera humano en una concentración nanomolar [4]. De hecho, un ensayo clínico que prueba la eficacia de este péptido en la prevención de la infección del VHB ha estado en curso [5]. Claramente, este péptido preS1 puede ser una sonda útil para extraer los factores celulares que interactúan, incluyendo receptores virales específicos. Yan et al. han tomado un enfoque razonable para pescar posibles receptores del VHB [6]. Ellos diseñaron el primer 2-47 péptido aminoácido de PreS1 para aumentar su capacidad para ser interconectado con proteínas que interactúan con la membrana celular, sin afectar a su especificidad de unión. Las estrategias realmente bajaron muchas proteínas de membrana, pero en comparación con el control negativo (péptido homológico sin unión específica), identificaron una proteína celular, NTCP (péptido de cotransporte de taurocolato sódico) por LC/MS/MS. La misma proteína también fue retirada de los hepatocitos humanos. Los autores produjeron líneas celulares de HCC que expresaban fuertemente NTCP y posteriormente las infectaron con HBV o HDV. La tinción de inmunofluorescencia demostró claramente la expresión de proteínas de HBV y HDV en estas líneas celulares, lo que sugiere una infección viral exitosa. Además, documentaron un aumento de 2-4 veces del ARN viral y ADN después de la infección en la línea celular por PCR en tiempo real. También mostraron una mancha sureña que apoya la presencia de ADN circular covalentemente cerrado de HBV en la célula infectada, un marcador bien reconocido para la infección Finalmente, identificaron un tramo de 10 aminoácidos en el dominio de la transmembrana NTCP, como el motivo que interactúa directamente con el péptido PreS1. NTCP es una proteína transmembrana, usualmente localizada en la superficie lateral (canalicular) de los hepatocitos, que media el transporte de ácido biliar [7]. Geográficamente, es un buen candidato para un receptor de VHB. Además, los autores podrían convertir las líneas celulares previamente no permisibles a la infección por VHB a permitidas por sobreexpresión de PCN, apoyando de nuevo su posible papel en el proceso de infección por VHB. Esto puede ser un descubrimiento crítico y esperado hacia la comprensión de los receptores de VHB y el establecimiento de un sistema experimental de infección por VHB. Mirando hacia adelante, necesitamos entender cómo el PCN interactúa con ambas proteínas de envoltura de VHB y con otras proteínas celulares, especialmente a través El NTCP en sí mismo no es suficiente para permitir la infección por VHB, ya que la mayoría de las células de HepaRG fueron encontradas para expresar el NPCT pero no para ser infectadas [8]. El NTCP podría iniciar o mediar interacciones moleculares que pueden superar las restricciones de la superficie celular para la entrada viral. Tales factores celulares o virales cooperativos deben ser descubiertos y demostrados para mejorar la eficiencia de la infección viral, a un nivel comparable a uno natural (cientos o miles de amplificación viral). Por ejemplo, los autores pueden utilizar las líneas celulares que expresan el NTCP como los materiales iniciales para identificar sistémicamente otros factores (tal vez carboxipeptidasa D) y hacer que estas líneas celulares sean más productivas y permisivas a la infección por VHB. En un futuro próximo, se espera que los ensayos virológicos estándar para las infecciones por VHB, incluyendo manchas del norte u oeste, La comunidad de investigación del VHB ha buscado receptores del VHB durante décadas. Muchos candidatos han sido descubiertos y luego descartados. El estudio actual, sin embargo, aprovechó un péptido viral bien documentado requerido para la entrada del VHB en combinación con una plataforma proteómica de última generación. Como dice un proverbio chino, "un viaje de mil millas comienza desde un paso gradual". Así, la identificación del NTCP como receptor viral potencial del VHB puede servir como un paso inicial importante para este viaje, llevando al desarrollo de un sistema de infección del VHB para facilitar la investigación del VHB y el tratamiento de la hepatitis B.
|
¿Qué dominio proteico del sobre de la Hepatitis B es necesario para la infección?
| false
| 2,998
|
{
"text": [
"Nterminus of HBV preS1 (amino acids 1-47)"
],
"answer_start": [
2168
]
}
|
Ntermina de HBV preS1 (aminoácidos 1-47)
|
1,552
|
Un paso más cerca de un sistema de infección experimental para el virus de la hepatitis B? --- la identificación del péptido cotransportador de taurocolato de sodio como receptor viralhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3562259/SHA: f4f36a8e9fee64d59ccf22b724c7dab345102658Autores: Chen, Pei-Jer; Wu, T-CFecha: 2013-01-11DOI: 10.1186/2045-3701-3-2Licencia: cc-byAbstract: Tras la clonación exitosa del receptor para el coronavirus del SARS hace unos años, el Dr. Wenhui Li y sus colegas volvieron a llamar la atención publicando un posible receptor para el virus de la hepatitis B en eLife. Revisaremos brevemente Texto: Entre los cinco virus hepatotrópicos de la hepatitis, sólo el virus de la hepatitis B (VHB) y su virus satélite de la hepatitis D (VHD) todavía esperan el desarrollo de un sistema de infección in vitro en el cultivo celular. Una línea celular de carcinoma hepatocelular (HCC), HepaRG, puede infectarse con una eficiencia modesta después de semanas de cultivo y diferenciación inducida [1]. Incluso los hepatocitos humanos primarios pierden rápidamente la capacidad de infección por el VHB después de un breve cultivo celular. La infección por el VHB exige factores tanto intracelulares como de superficie celular. Los requisitos intracelulares parecen menos estrictos, ya que después de la transfección del ADN del VHB en muchas líneas celulares del HCC o hígado de ratón, que no pueden infectarse naturalmente, el genoma viral se expresa y replica activamente. Así, el fracaso de la infección por el VHB se considera en gran parte debido a Las moléculas de la membrana celular necesarias para la infección por VHB pueden dividirse en dos clases: baja afinidad y alta afinidad. Entre otras, los sulfatos de heparano en las proteínas de la membrana median la interacción amplia, pero menos específica, de células víricas. Sin embargo, los socios de membrana de alta afinidad para el VHB siguen siendo elusivos (la carboxipeptidasa D encontrada para el virus de la hepatitis B del pato puede ser el único contendiente grave [2] ). La proteína de envoltura del VHB, a saber, los antígenos de superficie, desempeña un papel esencial en el proceso de infección. Ambos exámenes genéticos y funcionales identificaron un dominio en el Nterminus del VHB preS1 (aminoácidos 1-47) necesario para la infección. Se ha demostrado que este dominio funciona como mediador directo para el VHB mediante la unión de receptores (s) Más importante aún, el péptido miristoilado se muestra para bloquear efectivamente la infección del VHB en los hepatocitos humanos primarios y en el ratón hepatocytechimera humano en una concentración nanomolar [4]. De hecho, un ensayo clínico que prueba la eficacia de este péptido en la prevención de la infección del VHB ha estado en curso [5]. Claramente, este péptido preS1 puede ser una sonda útil para extraer los factores celulares que interactúan, incluyendo receptores virales específicos. Yan et al. han tomado un enfoque razonable para pescar posibles receptores del VHB [6]. Ellos diseñaron el primer 2-47 péptido aminoácido de PreS1 para aumentar su capacidad para ser interconectado con proteínas que interactúan con la membrana celular, sin afectar a su especificidad de unión. Las estrategias realmente bajaron muchas proteínas de membrana, pero en comparación con el control negativo (péptido homológico sin unión específica), identificaron una proteína celular, NTCP (péptido de cotransporte de taurocolato sódico) por LC/MS/MS. La misma proteína también fue retirada de los hepatocitos humanos. Los autores produjeron líneas celulares de HCC que expresaban fuertemente NTCP y posteriormente las infectaron con HBV o HDV. La tinción de inmunofluorescencia demostró claramente la expresión de proteínas de HBV y HDV en estas líneas celulares, lo que sugiere una infección viral exitosa. Además, documentaron un aumento de 2-4 veces del ARN viral y ADN después de la infección en la línea celular por PCR en tiempo real. También mostraron una mancha sureña que apoya la presencia de ADN circular covalentemente cerrado de HBV en la célula infectada, un marcador bien reconocido para la infección Finalmente, identificaron un tramo de 10 aminoácidos en el dominio de la transmembrana NTCP, como el motivo que interactúa directamente con el péptido PreS1. NTCP es una proteína transmembrana, usualmente localizada en la superficie lateral (canalicular) de los hepatocitos, que media el transporte de ácido biliar [7]. Geográficamente, es un buen candidato para un receptor de VHB. Además, los autores podrían convertir las líneas celulares previamente no permisibles a la infección por VHB a permitidas por sobreexpresión de PCN, apoyando de nuevo su posible papel en el proceso de infección por VHB. Esto puede ser un descubrimiento crítico y esperado hacia la comprensión de los receptores de VHB y el establecimiento de un sistema experimental de infección por VHB. Mirando hacia adelante, necesitamos entender cómo el PCN interactúa con ambas proteínas de envoltura de VHB y con otras proteínas celulares, especialmente a través El NTCP en sí mismo no es suficiente para permitir la infección por VHB, ya que la mayoría de las células de HepaRG fueron encontradas para expresar el NPCT pero no para ser infectadas [8]. El NTCP podría iniciar o mediar interacciones moleculares que pueden superar las restricciones de la superficie celular para la entrada viral. Tales factores celulares o virales cooperativos deben ser descubiertos y demostrados para mejorar la eficiencia de la infección viral, a un nivel comparable a uno natural (cientos o miles de amplificación viral). Por ejemplo, los autores pueden utilizar las líneas celulares que expresan el NTCP como los materiales iniciales para identificar sistémicamente otros factores (tal vez carboxipeptidasa D) y hacer que estas líneas celulares sean más productivas y permisivas a la infección por VHB. En un futuro próximo, se espera que los ensayos virológicos estándar para las infecciones por VHB, incluyendo manchas del norte u oeste, La comunidad de investigación del VHB ha buscado receptores del VHB durante décadas. Muchos candidatos han sido descubiertos y luego descartados. El estudio actual, sin embargo, aprovechó un péptido viral bien documentado requerido para la entrada del VHB en combinación con una plataforma proteómica de última generación. Como dice un proverbio chino, "un viaje de mil millas comienza desde un paso gradual". Así, la identificación del NTCP como receptor viral potencial del VHB puede servir como un paso inicial importante para este viaje, llevando al desarrollo de un sistema de infección del VHB para facilitar la investigación del VHB y el tratamiento de la hepatitis B.
|
¿Dónde se encuentra NTCP en el cuerpo?
| false
| 2,999
|
{
"text": [
"lateral surface (canalicular) of hepatocytes"
],
"answer_start": [
4322
]
}
|
superficie lateral (canalicular) de los hepatocitos
|
1,552
|
Un paso más cerca de un sistema de infección experimental para el virus de la hepatitis B? --- la identificación del péptido cotransportador de taurocolato de sodio como receptor viralhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3562259/SHA: f4f36a8e9fee64d59ccf22b724c7dab345102658Autores: Chen, Pei-Jer; Wu, T-CFecha: 2013-01-11DOI: 10.1186/2045-3701-3-2Licencia: cc-byAbstract: Tras la clonación exitosa del receptor para el coronavirus del SARS hace unos años, el Dr. Wenhui Li y sus colegas volvieron a llamar la atención publicando un posible receptor para el virus de la hepatitis B en eLife. Revisaremos brevemente Texto: Entre los cinco virus hepatotrópicos de la hepatitis, sólo el virus de la hepatitis B (VHB) y su virus satélite de la hepatitis D (VHD) todavía esperan el desarrollo de un sistema de infección in vitro en el cultivo celular. Una línea celular de carcinoma hepatocelular (HCC), HepaRG, puede infectarse con una eficiencia modesta después de semanas de cultivo y diferenciación inducida [1]. Incluso los hepatocitos humanos primarios pierden rápidamente la capacidad de infección por el VHB después de un breve cultivo celular. La infección por el VHB exige factores tanto intracelulares como de superficie celular. Los requisitos intracelulares parecen menos estrictos, ya que después de la transfección del ADN del VHB en muchas líneas celulares del HCC o hígado de ratón, que no pueden infectarse naturalmente, el genoma viral se expresa y replica activamente. Así, el fracaso de la infección por el VHB se considera en gran parte debido a Las moléculas de la membrana celular necesarias para la infección por VHB pueden dividirse en dos clases: baja afinidad y alta afinidad. Entre otras, los sulfatos de heparano en las proteínas de la membrana median la interacción amplia, pero menos específica, de células víricas. Sin embargo, los socios de membrana de alta afinidad para el VHB siguen siendo elusivos (la carboxipeptidasa D encontrada para el virus de la hepatitis B del pato puede ser el único contendiente grave [2] ). La proteína de envoltura del VHB, a saber, los antígenos de superficie, desempeña un papel esencial en el proceso de infección. Ambos exámenes genéticos y funcionales identificaron un dominio en el Nterminus del VHB preS1 (aminoácidos 1-47) necesario para la infección. Se ha demostrado que este dominio funciona como mediador directo para el VHB mediante la unión de receptores (s) Más importante aún, el péptido miristoilado se muestra para bloquear efectivamente la infección del VHB en los hepatocitos humanos primarios y en el ratón hepatocytechimera humano en una concentración nanomolar [4]. De hecho, un ensayo clínico que prueba la eficacia de este péptido en la prevención de la infección del VHB ha estado en curso [5]. Claramente, este péptido preS1 puede ser una sonda útil para extraer los factores celulares que interactúan, incluyendo receptores virales específicos. Yan et al. han tomado un enfoque razonable para pescar posibles receptores del VHB [6]. Ellos diseñaron el primer 2-47 péptido aminoácido de PreS1 para aumentar su capacidad para ser interconectado con proteínas que interactúan con la membrana celular, sin afectar a su especificidad de unión. Las estrategias realmente bajaron muchas proteínas de membrana, pero en comparación con el control negativo (péptido homológico sin unión específica), identificaron una proteína celular, NTCP (péptido de cotransporte de taurocolato sódico) por LC/MS/MS. La misma proteína también fue retirada de los hepatocitos humanos. Los autores produjeron líneas celulares de HCC que expresaban fuertemente NTCP y posteriormente las infectaron con HBV o HDV. La tinción de inmunofluorescencia demostró claramente la expresión de proteínas de HBV y HDV en estas líneas celulares, lo que sugiere una infección viral exitosa. Además, documentaron un aumento de 2-4 veces del ARN viral y ADN después de la infección en la línea celular por PCR en tiempo real. También mostraron una mancha sureña que apoya la presencia de ADN circular covalentemente cerrado de HBV en la célula infectada, un marcador bien reconocido para la infección Finalmente, identificaron un tramo de 10 aminoácidos en el dominio de la transmembrana NTCP, como el motivo que interactúa directamente con el péptido PreS1. NTCP es una proteína transmembrana, usualmente localizada en la superficie lateral (canalicular) de los hepatocitos, que media el transporte de ácido biliar [7]. Geográficamente, es un buen candidato para un receptor de VHB. Además, los autores podrían convertir las líneas celulares previamente no permisibles a la infección por VHB a permitidas por sobreexpresión de PCN, apoyando de nuevo su posible papel en el proceso de infección por VHB. Esto puede ser un descubrimiento crítico y esperado hacia la comprensión de los receptores de VHB y el establecimiento de un sistema experimental de infección por VHB. Mirando hacia adelante, necesitamos entender cómo el PCN interactúa con ambas proteínas de envoltura de VHB y con otras proteínas celulares, especialmente a través El NTCP en sí mismo no es suficiente para permitir la infección por VHB, ya que la mayoría de las células de HepaRG fueron encontradas para expresar el NPCT pero no para ser infectadas [8]. El NTCP podría iniciar o mediar interacciones moleculares que pueden superar las restricciones de la superficie celular para la entrada viral. Tales factores celulares o virales cooperativos deben ser descubiertos y demostrados para mejorar la eficiencia de la infección viral, a un nivel comparable a uno natural (cientos o miles de amplificación viral). Por ejemplo, los autores pueden utilizar las líneas celulares que expresan el NTCP como los materiales iniciales para identificar sistémicamente otros factores (tal vez carboxipeptidasa D) y hacer que estas líneas celulares sean más productivas y permisivas a la infección por VHB. En un futuro próximo, se espera que los ensayos virológicos estándar para las infecciones por VHB, incluyendo manchas del norte u oeste, La comunidad de investigación del VHB ha buscado receptores del VHB durante décadas. Muchos candidatos han sido descubiertos y luego descartados. El estudio actual, sin embargo, aprovechó un péptido viral bien documentado requerido para la entrada del VHB en combinación con una plataforma proteómica de última generación. Como dice un proverbio chino, "un viaje de mil millas comienza desde un paso gradual". Así, la identificación del NTCP como receptor viral potencial del VHB puede servir como un paso inicial importante para este viaje, llevando al desarrollo de un sistema de infección del VHB para facilitar la investigación del VHB y el tratamiento de la hepatitis B.
|
¿Qué media la proteína NTCP?
| false
| 3,000
|
{
"text": [
"bile acid transport"
],
"answer_start": [
4383
]
}
|
Transporte de ácido biliar
|
1,552
|
Un paso más cerca de un sistema de infección experimental para el virus de la hepatitis B? --- la identificación del péptido cotransportador de taurocolato de sodio como receptor viralhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3562259/SHA: f4f36a8e9fee64d59ccf22b724c7dab345102658Autores: Chen, Pei-Jer; Wu, T-CFecha: 2013-01-11DOI: 10.1186/2045-3701-3-2Licencia: cc-byAbstract: Tras la clonación exitosa del receptor para el coronavirus del SARS hace unos años, el Dr. Wenhui Li y sus colegas volvieron a llamar la atención publicando un posible receptor para el virus de la hepatitis B en eLife. Revisaremos brevemente Texto: Entre los cinco virus hepatotrópicos de la hepatitis, sólo el virus de la hepatitis B (VHB) y su virus satélite de la hepatitis D (VHD) todavía esperan el desarrollo de un sistema de infección in vitro en el cultivo celular. Una línea celular de carcinoma hepatocelular (HCC), HepaRG, puede infectarse con una eficiencia modesta después de semanas de cultivo y diferenciación inducida [1]. Incluso los hepatocitos humanos primarios pierden rápidamente la capacidad de infección por el VHB después de un breve cultivo celular. La infección por el VHB exige factores tanto intracelulares como de superficie celular. Los requisitos intracelulares parecen menos estrictos, ya que después de la transfección del ADN del VHB en muchas líneas celulares del HCC o hígado de ratón, que no pueden infectarse naturalmente, el genoma viral se expresa y replica activamente. Así, el fracaso de la infección por el VHB se considera en gran parte debido a Las moléculas de la membrana celular necesarias para la infección por VHB pueden dividirse en dos clases: baja afinidad y alta afinidad. Entre otras, los sulfatos de heparano en las proteínas de la membrana median la interacción amplia, pero menos específica, de células víricas. Sin embargo, los socios de membrana de alta afinidad para el VHB siguen siendo elusivos (la carboxipeptidasa D encontrada para el virus de la hepatitis B del pato puede ser el único contendiente grave [2] ). La proteína de envoltura del VHB, a saber, los antígenos de superficie, desempeña un papel esencial en el proceso de infección. Ambos exámenes genéticos y funcionales identificaron un dominio en el Nterminus del VHB preS1 (aminoácidos 1-47) necesario para la infección. Se ha demostrado que este dominio funciona como mediador directo para el VHB mediante la unión de receptores (s) Más importante aún, el péptido miristoilado se muestra para bloquear efectivamente la infección del VHB en los hepatocitos humanos primarios y en el ratón hepatocytechimera humano en una concentración nanomolar [4]. De hecho, un ensayo clínico que prueba la eficacia de este péptido en la prevención de la infección del VHB ha estado en curso [5]. Claramente, este péptido preS1 puede ser una sonda útil para extraer los factores celulares que interactúan, incluyendo receptores virales específicos. Yan et al. han tomado un enfoque razonable para pescar posibles receptores del VHB [6]. Ellos diseñaron el primer 2-47 péptido aminoácido de PreS1 para aumentar su capacidad para ser interconectado con proteínas que interactúan con la membrana celular, sin afectar a su especificidad de unión. Las estrategias realmente bajaron muchas proteínas de membrana, pero en comparación con el control negativo (péptido homológico sin unión específica), identificaron una proteína celular, NTCP (péptido de cotransporte de taurocolato sódico) por LC/MS/MS. La misma proteína también fue retirada de los hepatocitos humanos. Los autores produjeron líneas celulares de HCC que expresaban fuertemente NTCP y posteriormente las infectaron con HBV o HDV. La tinción de inmunofluorescencia demostró claramente la expresión de proteínas de HBV y HDV en estas líneas celulares, lo que sugiere una infección viral exitosa. Además, documentaron un aumento de 2-4 veces del ARN viral y ADN después de la infección en la línea celular por PCR en tiempo real. También mostraron una mancha sureña que apoya la presencia de ADN circular covalentemente cerrado de HBV en la célula infectada, un marcador bien reconocido para la infección Finalmente, identificaron un tramo de 10 aminoácidos en el dominio de la transmembrana NTCP, como el motivo que interactúa directamente con el péptido PreS1. NTCP es una proteína transmembrana, usualmente localizada en la superficie lateral (canalicular) de los hepatocitos, que media el transporte de ácido biliar [7]. Geográficamente, es un buen candidato para un receptor de VHB. Además, los autores podrían convertir las líneas celulares previamente no permisibles a la infección por VHB a permitidas por sobreexpresión de PCN, apoyando de nuevo su posible papel en el proceso de infección por VHB. Esto puede ser un descubrimiento crítico y esperado hacia la comprensión de los receptores de VHB y el establecimiento de un sistema experimental de infección por VHB. Mirando hacia adelante, necesitamos entender cómo el PCN interactúa con ambas proteínas de envoltura de VHB y con otras proteínas celulares, especialmente a través El NTCP en sí mismo no es suficiente para permitir la infección por VHB, ya que la mayoría de las células de HepaRG fueron encontradas para expresar el NPCT pero no para ser infectadas [8]. El NTCP podría iniciar o mediar interacciones moleculares que pueden superar las restricciones de la superficie celular para la entrada viral. Tales factores celulares o virales cooperativos deben ser descubiertos y demostrados para mejorar la eficiencia de la infección viral, a un nivel comparable a uno natural (cientos o miles de amplificación viral). Por ejemplo, los autores pueden utilizar las líneas celulares que expresan el NTCP como los materiales iniciales para identificar sistémicamente otros factores (tal vez carboxipeptidasa D) y hacer que estas líneas celulares sean más productivas y permisivas a la infección por VHB. En un futuro próximo, se espera que los ensayos virológicos estándar para las infecciones por VHB, incluyendo manchas del norte u oeste, La comunidad de investigación del VHB ha buscado receptores del VHB durante décadas. Muchos candidatos han sido descubiertos y luego descartados. El estudio actual, sin embargo, aprovechó un péptido viral bien documentado requerido para la entrada del VHB en combinación con una plataforma proteómica de última generación. Como dice un proverbio chino, "un viaje de mil millas comienza desde un paso gradual". Así, la identificación del NTCP como receptor viral potencial del VHB puede servir como un paso inicial importante para este viaje, llevando al desarrollo de un sistema de infección del VHB para facilitar la investigación del VHB y el tratamiento de la hepatitis B.
|
¿Es el NTCP suficiente para permitir la infección por VHB?
| false
| 3,001
|
{
"text": [
"not sufficient"
],
"answer_start": [
5012
]
}
|
no es suficiente
|
1,552
|
Un paso más cerca de un sistema de infección experimental para el virus de la hepatitis B? --- la identificación del péptido cotransportador de taurocolato de sodio como receptor viralhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3562259/SHA: f4f36a8e9fee64d59ccf22b724c7dab345102658Autores: Chen, Pei-Jer; Wu, T-CFecha: 2013-01-11DOI: 10.1186/2045-3701-3-2Licencia: cc-byAbstract: Tras la clonación exitosa del receptor para el coronavirus del SARS hace unos años, el Dr. Wenhui Li y sus colegas volvieron a llamar la atención publicando un posible receptor para el virus de la hepatitis B en eLife. Revisaremos brevemente Texto: Entre los cinco virus hepatotrópicos de la hepatitis, sólo el virus de la hepatitis B (VHB) y su virus satélite de la hepatitis D (VHD) todavía esperan el desarrollo de un sistema de infección in vitro en el cultivo celular. Una línea celular de carcinoma hepatocelular (HCC), HepaRG, puede infectarse con una eficiencia modesta después de semanas de cultivo y diferenciación inducida [1]. Incluso los hepatocitos humanos primarios pierden rápidamente la capacidad de infección por el VHB después de un breve cultivo celular. La infección por el VHB exige factores tanto intracelulares como de superficie celular. Los requisitos intracelulares parecen menos estrictos, ya que después de la transfección del ADN del VHB en muchas líneas celulares del HCC o hígado de ratón, que no pueden infectarse naturalmente, el genoma viral se expresa y replica activamente. Así, el fracaso de la infección por el VHB se considera en gran parte debido a Las moléculas de la membrana celular necesarias para la infección por VHB pueden dividirse en dos clases: baja afinidad y alta afinidad. Entre otras, los sulfatos de heparano en las proteínas de la membrana median la interacción amplia, pero menos específica, de células víricas. Sin embargo, los socios de membrana de alta afinidad para el VHB siguen siendo elusivos (la carboxipeptidasa D encontrada para el virus de la hepatitis B del pato puede ser el único contendiente grave [2] ). La proteína de envoltura del VHB, a saber, los antígenos de superficie, desempeña un papel esencial en el proceso de infección. Ambos exámenes genéticos y funcionales identificaron un dominio en el Nterminus del VHB preS1 (aminoácidos 1-47) necesario para la infección. Se ha demostrado que este dominio funciona como mediador directo para el VHB mediante la unión de receptores (s) Más importante aún, el péptido miristoilado se muestra para bloquear efectivamente la infección del VHB en los hepatocitos humanos primarios y en el ratón hepatocytechimera humano en una concentración nanomolar [4]. De hecho, un ensayo clínico que prueba la eficacia de este péptido en la prevención de la infección del VHB ha estado en curso [5]. Claramente, este péptido preS1 puede ser una sonda útil para extraer los factores celulares que interactúan, incluyendo receptores virales específicos. Yan et al. han tomado un enfoque razonable para pescar posibles receptores del VHB [6]. Ellos diseñaron el primer 2-47 péptido aminoácido de PreS1 para aumentar su capacidad para ser interconectado con proteínas que interactúan con la membrana celular, sin afectar a su especificidad de unión. Las estrategias realmente bajaron muchas proteínas de membrana, pero en comparación con el control negativo (péptido homológico sin unión específica), identificaron una proteína celular, NTCP (péptido de cotransporte de taurocolato sódico) por LC/MS/MS. La misma proteína también fue retirada de los hepatocitos humanos. Los autores produjeron líneas celulares de HCC que expresaban fuertemente NTCP y posteriormente las infectaron con HBV o HDV. La tinción de inmunofluorescencia demostró claramente la expresión de proteínas de HBV y HDV en estas líneas celulares, lo que sugiere una infección viral exitosa. Además, documentaron un aumento de 2-4 veces del ARN viral y ADN después de la infección en la línea celular por PCR en tiempo real. También mostraron una mancha sureña que apoya la presencia de ADN circular covalentemente cerrado de HBV en la célula infectada, un marcador bien reconocido para la infección Finalmente, identificaron un tramo de 10 aminoácidos en el dominio de la transmembrana NTCP, como el motivo que interactúa directamente con el péptido PreS1. NTCP es una proteína transmembrana, usualmente localizada en la superficie lateral (canalicular) de los hepatocitos, que media el transporte de ácido biliar [7]. Geográficamente, es un buen candidato para un receptor de VHB. Además, los autores podrían convertir las líneas celulares previamente no permisibles a la infección por VHB a permitidas por sobreexpresión de PCN, apoyando de nuevo su posible papel en el proceso de infección por VHB. Esto puede ser un descubrimiento crítico y esperado hacia la comprensión de los receptores de VHB y el establecimiento de un sistema experimental de infección por VHB. Mirando hacia adelante, necesitamos entender cómo el PCN interactúa con ambas proteínas de envoltura de VHB y con otras proteínas celulares, especialmente a través El NTCP en sí mismo no es suficiente para permitir la infección por VHB, ya que la mayoría de las células de HepaRG fueron encontradas para expresar el NPCT pero no para ser infectadas [8]. El NTCP podría iniciar o mediar interacciones moleculares que pueden superar las restricciones de la superficie celular para la entrada viral. Tales factores celulares o virales cooperativos deben ser descubiertos y demostrados para mejorar la eficiencia de la infección viral, a un nivel comparable a uno natural (cientos o miles de amplificación viral). Por ejemplo, los autores pueden utilizar las líneas celulares que expresan el NTCP como los materiales iniciales para identificar sistémicamente otros factores (tal vez carboxipeptidasa D) y hacer que estas líneas celulares sean más productivas y permisivas a la infección por VHB. En un futuro próximo, se espera que los ensayos virológicos estándar para las infecciones por VHB, incluyendo manchas del norte u oeste, La comunidad de investigación del VHB ha buscado receptores del VHB durante décadas. Muchos candidatos han sido descubiertos y luego descartados. El estudio actual, sin embargo, aprovechó un péptido viral bien documentado requerido para la entrada del VHB en combinación con una plataforma proteómica de última generación. Como dice un proverbio chino, "un viaje de mil millas comienza desde un paso gradual". Así, la identificación del NTCP como receptor viral potencial del VHB puede servir como un paso inicial importante para este viaje, llevando al desarrollo de un sistema de infección del VHB para facilitar la investigación del VHB y el tratamiento de la hepatitis B.
|
¿Por qué se cree que el NTCP no es suficiente para la infección por VHB?
| false
| 3,002
|
{
"text": [
"the majority of HepaRG cells were found to express NPCT but not to be infected"
],
"answer_start": [
5054
]
}
|
la mayoría de las células HepaRG expresaban NPCT pero no estaban infectadas
|
1,553
|
El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado
|
¿Qué tipos de virus son el virus japonés de la encefalitis (JEV), el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), el virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), el virus sindbis (SV) y el virus del dengue (DV)?
| false
| 3,003
|
{
"text": [
"arboviruses"
],
"answer_start": [
1906
]
}
|
arbovirus
|
1,553
|
El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado
|
¿Cuáles son los métodos disponibles clínicamente para detectar antígenos virales de la encefalitis?
| false
| 3,004
|
{
"text": [
"ELISA and IFA"
],
"answer_start": [
2177
]
}
|
ELISA e IFA
|
1,553
|
El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado
|
¿Qué métodos existen para detectar múltiples antígenos simultáneamente en una prueba de laboratorio de una muestra?
| false
| 3,005
|
{
"text": [
"two-dimensional gel electrophoresis , protein chip, mass spectrometry, and suspension array technology"
],
"answer_start": [
2474
]
}
|
electroforesis de gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión
|
1,553
|
El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado
|
¿Cuántos antígenos podrían ser detectados por la prueba ELISA multiplex de Liew?
| false
| 3,006
|
{
"text": [
"9"
],
"answer_start": [
2923
]
}
|
9
|
1,553
|
El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado
|
¿Qué tipo de anticuerpos se utilizaron en el ensayo ELISA-array?
| false
| 3,007
|
{
"text": [
"monoclonal"
],
"answer_start": [
3480
]
}
|
monoclonal
|
1,553
|
El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado
|
¿Cómo se validó el ensayo ELISA?
| false
| 3,008
|
{
"text": [
"using cultured viruses and inoculated chicken eggs with patient sera"
],
"answer_start": [
3618
]
}
|
utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con sueros de paciente
|
1,553
|
El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado
|
¿Qué anticuerpos de captura se utilizaron en el estudio?
| false
| 3,009
|
{
"text": [
"4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9, and 4E11"
],
"answer_start": [
4365
]
}
|
4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11
|
1,553
|
El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado
|
¿Cuál fue el rango de concentración de los anticuerpos de captura?
| false
| 3,010
|
{
"text": [
"from 0.2 to 0.0125 mg/ml"
],
"answer_start": [
9091
]
}
|
de 0,2 a 0,0125 mg/ml
|
1,553
|
El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado
|
¿Cómo se determinó la concentración de manchado adecuada?
| false
| 3,011
|
{
"text": [
"combination of minimized cross reaction and higher signal intensity"
],
"answer_start": [
9317
]
}
|
combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal
|
1,553
|
El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado
|
¿Cómo se determinó la detección de reacciones cruzadas?
| false
| 3,012
|
{
"text": [
"by applying JEV, YF, and DV cultures"
],
"answer_start": [
9606
]
}
|
mediante la aplicación de cultivos JEV, YF y DV
|
1,553
|
El desarrollo de una guía ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9eb49122Autores: Kang, Xiaoping; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Hong; Yang, YinhuiFecha: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56Licencia: cc-byAbstract: virus de la encefalitis japonesa(JEV), virus de El establecimiento de métodos precisos y fáciles para detectar estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, todavía no existen métodos de detección de antígenos múltiples disponibles clínicamente. En este estudio se desarrolló un sistema ELISA-array para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis. Se prepararon siete anticuerpos monoclonales contra cinco virus asociados a la encefalitis y se utilizaron para el desarrollo del sistema ELISA-array. El ensayo ELISA-array se basa en un formato ELISA "sandwich" y consiste en anticuerpos virales impresos directamente en placas microtiterizadas de 96 pocillos, lo que permite la detección directa de 5 virus. El sistema ELISA-array desarrollado demostró tener una especificidad similar y una mayor sensibilidad en comparación con las ELISA convencionales. Este método fue validado por diferentes cultivos virales y tres huevos de pollo inoculados con suero de paciente infectado. Los resultados demostraron que el vector ELISA desarrollado es sensible y fácil de usar, lo que tendría potencial de uso clínico. Texto: virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus sindbis (SV), y virus del dengue (DV) son arbovirus y causan síntomas de encefalitis, con una amplia gama de gravedad y tasas de mortalidad [1]. El establecimiento de un método preciso y fácil para la detección de estos virus es esencial para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas asociadas. Actualmente, ELISA e IFA son los métodos que están clínicamente disponibles para la detección de antígenos virales de encefalitis, pero sólo pudieron detectar un patógeno en un Hay una variedad de métodos diferentes disponibles para identificar antígenos múltiples en una muestra simultáneamente, tales como electroforesis gel bidimensional, chip de proteína, espectrometría de masas y tecnología de matriz de suspensión [4] [5] [6]. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas en la detección de patógenos todavía se encuentra en una fase temprana, tal vez debido al uso complicado y alto costo. Arrays de anticuerpos para la cuantificación simultánea de antígenos múltiples se consideran los métodos más precisos [7] [8] [9] [10]. Liew [11] validó una ELISA múltiple para la detección de 9 antígenos; Anderson [12] utilizó el microarray ELISA para la detección multiplex de anticuerpos a antígenos tumorales en el cáncer de mama, y demostró que los análisis de matrices basados en ELISA tenían el rango dinámico más amplio y los requisitos de volumen de muestra más bajo en comparación con los otros ensayos. Sin embargo, la aplicación de matrices basadas en ELISA se limita actualmente En este estudio, se desarrolló una matriz con base ELISA para la detección simultánea de cinco virus de la encefalitis, se prepararon siete anticuerpos monoclonales específicos contra cinco virus de la encefalitis y se utilizó para establecer un ensayo ELISA-array. El ensayo fue validado utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con suero paciente. Los resultados demostraron que este método combinaba la ventaja de ELISA y matriz proteica (multiplex y facilidad de uso) y tiene potencial para la identificación del virus de la encefalitis clínica. Los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de líneas celulares de hibridoma construidas por el Prof. Zhu et al. La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad en sepharose de afinidad proteica G [13]. Para este estudio se seleccionaron anticuerpos monoclonales específicos (4D5 frente a JEV, 2B5 frente a TVEV, 1F1 frente a SV, 2B8 frente a serotipo 2 DV, 4F9 frente a serotipo 4 DV, 4E11 frente a EEV y 2A10 frente a Flavivirus). Todos los anticuerpos se elevaron de acuerdo con los procedimientos estándar.Utilizando 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 y 4E11 como anticuerpos de captura, anticuerpos de detección (2A10, 1 F1 y 4E11) se acoplaron a ester de biotina-NHS (Pierce, Alemania) a 4°C durante 3 h según las instrucciones del fabricante.La biotina no incorporada fue eliminada por la columna de rotación Desalt (Pierce). Las reacciones inmunológicas fueron notificadas por Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) y Super Signal ELISA Femto Sustrato Sensible Máximo. Se utilizó como control positivo el anticuerpo cabra-anti ratón purificado. JEV y DV fueron cultivadas en C6/36 células; SV, TBEV y EEEV fueron cultivadas en células BHK-21. El cultivo de TBEV y EEV fue realizado en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad, sin embargo, JEV, DV y SV fueron realizadas en instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. Los títulos virales fueron determinados por el método de la dosis infecciosa de cultivo tisular 50% (TCID 50 ). Todos los cultivos fueron inactivados por 0,025% β-propionolactona a 4°C durante la noche, luego 37°C Los anticuerpos fueron detectados utilizando una máquina BIODOT (BD6000;California, EE.UU.) en placas ELISA (30 nl/punto). Las placas fueron bloqueadas con 3 % BSA-PBS en 37°C durante 1 h, seguidas de lavado 3 veces con PBS que contenía 0,1% Tween-20 durante 2 minutos cada una. Luego, las placas fueron secas, selladas y almacenadas a 4°C antes de su uso [11]. Cuando se detectaron, se evaluaron diferentes tampones y concentraciones de anticuerpos monoclonales de captura para optimizar el ensayo ELISA-array. La optimización fue evaluada por morfología de punto e intensidad de señal. Los tampones de detección probados incluyeron 1 x fosfato tampón salino (PBS), PBS +20% glicerol, y 1 × PBS + 20% glicerol+0,004% Se comparó un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 mg/ml). Tras un formato sándwich de doble anticuerpo, las placas impresas fueron incubadas secuencialmente con cultivos virales inactivados, anticuerpos de detección marcados con biotina, avidina y sustrato marcados con HPR, seguidos de una evaluación de la señal. La unión de antígenos se realizó en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h, seguido de lavado 3 veces (1 × PBS con 0,1% Tween-20). La incubación de placas ELISA con cocteles anticuerpos de detección biotinilados fue realizada en PBS (conteniendo 0,1% Tween-20 y 5% FCS) a 37°C durante 2 h. Después del lavado, la unión específica de los anticuerpos de detección fue reportada por estreptavidina-HRP y teñida con Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible (Thermo científico, Rockford, EE.UU.) [11, 14, 15]. La visualización de la placa fue realizada en AE 1000 analizador de imagen CCD fresco (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, China). La intensidad de la señal y el fondo de cada mancha fue leída y grabada con "Monster"software. Las señales positivas fueron definidas como un valor de señal > 400 y un valor de señal (muestra)/valor de señal Los anticuerpos idénticos utilizados en el formato ELISA-array también fueron probados en un formato ELISA convencional para determinar la diferencia en sensibilidad y especificidad de los dos métodos. Las ELISA convencionales se realizaron al mismo tiempo que los ensayos ELISA-array para asegurar condiciones de reacción similares. Las ELISA convencionales se realizaron en una forma idéntica a la ELISA-array, excepto que los anticuerpos fueron recubiertos con una concentración de 2 μg/ml en PBS (pH 7,4) y se utilizó el sustrato TMB en lugar de Super Signal ELISA Femto Sustrato Máximo Sensible [16, 17]. Se recolectaron tres muestras séricas de pacientes con síntomas del sistema nervioso e historias de picaduras de garrapatas. Las muestras séricas fueron tratadas con penicilina y estreptomicina, luego inoculadas en las cavidades alantóicas de huevos de pollo. 3 días después, el líquido fue recogido y dividido en dos porciones (una para inactivación y otra para extracción de ARN). El ARN y las muestras inactivadas fueron almacenadas a -70°C antes de su uso. El ARN se extrajo de los huevos de pollo inoculados utilizando un mini kit RNAasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos de extracción de ARN se realizaron en instalaciones de BSL-3. Los imprimadores y sondas se utilizaron como se describió anteriormente [18]. El RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo con un Quti-teck q-RT-PCR Kit (Qiagen Inc.). La reacción consistió en 10 μL de 2 × tampón de reacción (0,2 μL enzima de transcripción inversa, y 250 nmol La PCR se realizó con un LightCycler 2.0 (Roche, Suiza) [19]. Optimización del ensayo ELISA-arrayEl diseño del array manchado se muestra en la Figura 1 y la eficacia de tres tampones de manchado diferentes en la calidad de los rayos ELISA impresos fueron investigados por observación morfológica puntual y comparación de intensidad de señal. La concentración de manchado de los anticuerpos de captura varió de 0,2 a 0,0125 mg/ml (cada uno se diluyó en serie 2 veces). La eficacia de la concentración de manchado de los anticuerpos de captura fue evaluada por detección del cultivo del virus, la concentración de manchado adecuada fue determinada por una combinación de reacción cruzada minimizada y mayor intensidad de señal. La Figura 1 ilustra el diseño del array y la Figura 2 muestra el resultado de los tres tampones de manchado y concentración de manchado de anticuerpos 2B5 por La observación de la morfología puntual (Figuras 2a, b y 2c) demostró que el tampón de detección que contiene PBS con 20% de glicerol produjo morfología puntual; los tampones que contienen PBS solo y PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 dieron buena morfología puntual (redondo y completo). Los tampones que contienen PBS con 20% de glicerol y PBS con 20% de glicerol+0,004% de Triton-X100 produjeron intensidades de señal más altas que el PBS solo. Así, PBS con 20% de glicerol +0,004% de Triton-X100 fue adoptado como el tampón de detección optimizado para experimentos posteriores. Simultáneamente, la evaluación de la concentración puntual sugirió que 0,05 mg/ml era óptima. A esta concentración, la intensidad de la señal fue mayor y la reacción cruzada no En consecuencia, la optimización de la concentración de detección de otros anticuerpos de captura (4D5, 1F1, 4E11 y 2B8) demostró que 0,05 mg/ml también eran adecuados (datos no mostrados). La disposición optimizada de la matriz ELISA se muestra en la Figura 3, que se aplicó en los siguientes experimentos. La detección exitosa de patógenos virales requiere una prueba con alta sensibilidad y especificidad. Para evaluar el rendimiento de las matrices de anticuerpos diseñadas, se examinó la especificidad y sensibilidad de los analitos individuales. Mediante la prueba de cultivos virales serialmente diluidos, incluyendo DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV y EEEV, se comparó la sensibilidad de ELISAarray y la ELISA convencional idéntica ( Tabla 1 ). Se comparó y demostró el límite de detección de los dos métodos. La prueba de reactividad cruzada se realizó utilizando cultivos de BHK-21 y lisato de células de vero, virus de la fiebre amarilla (YFV) (5 × 10 5 TCID 50/ml, cultivos de virus del Nilo Occidental (WNV)(2 × 10 6 TCID 50/ml) y virus de la encefalitis equina occidental(1 × 10 7 TCID 50/ml). Los resultados demostraron que ni el vector ELISA ni el ELISA tradicional mostraron reactividad cruzada.En todas las pruebas se prepararon volúmenes iguales de TVEV, JEV, DV-2, DV-4, SV y EEEV para la detección de muestras únicas; dos o tres de los cultivos se mezclaron para la detección múltiplex. Se utilizó un cóctel de anticuerpo conjugado de biotina (2A10, 4E11 y 1F1). Los resultados demostraron que para todas las combinaciones virales, cada virus fue detectado específicamente, sin resultados falsos positivos o negativos (Figuras 4 y 5). Los huevos de pollo inoculados con suero humano infectado fueron utilizados para la validación del ensayo ELISA-array. Todas las muestras mostraron señales de alta reacción con anticuerpo de captura 2B5, que fue específico para TBEV (Figura 6b ). El ensayo ELISA-array sugirió que los tres pacientes estaban infectados con TBEV. Para verificar los resultados probados por ELISA-array, el ARN extraído de huevos de pollo se aplicó a un ensayo RT-PCR en tiempo real utilizando imprimadores y sondas dirigidas a TBEV. Los resultados también fueron positivos (Figura 6a). Los resultados de la detección de consenso confirmaron que el ensayo ELISAarray era confiable. Para ser ampliamente utilizado en el entorno clínico, el sistema de detección debe ser fácil de usar y puede ser realizado por personal no capacitado con poca experiencia de laboratorio y experimental. Además, cuando el volumen de las muestras clínicas es limitado y un número creciente de patógenos por muestra necesita ser probado, el sistema de detección debe ser de alto rendimiento para permitir la detección de múltiples patógenos simultáneamente [6, 20, 21]. Detección múltiple, fácil de usar y asequibilidad son requisitos para los métodos de detección en el entorno clínico. Por lo tanto, una revisión ELISA, que combina las ventajas de ELISA y matriz de proteínas, cumple los requisitos anteriores. Se ha reportado que una revisión ELISA se ha utilizado en el diagnóstico de cáncer y enfermedad autoalérgica [7, 12] ; sin embargo, ningún estudio ha reportado la detección de patógenos virales. En este estudio se desarrolló un método multiplex basado en ELISA en un sandwich de doble anticuerpo para la detección simultánea de cinco patógenos virales asociados a la encefalitis. La producción de un chip de anticuerpos confiable para la identificación de microorganismos requiere una cuidadosa detección de la captura de anticuerpos [14]. Se debe minimizar la reactividad cruzada y la afinidad del anticuerpo es tan importante como la especificidad. En primer lugar, se preparó y examinó 23 anticuerpos monoclonales contra ocho virus y se verificó la especificidad y afinidad con los virus objetivo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Luego, los anticuerpos fueron analizados por una matriz ELISA con un sandwich de doble anticuerpo formato ELISA. Se excluyeron los anticuerpos que produjeron reactividad cruzada y señales de baja positivo. Finalmente, se seleccionaron seis anticuerpos como anticuerpos de captura. Otro anticuerpo monoclonal, 2A10, que podría reaccionar específicamente con todos los virus del género Flavivirus, fue utilizado para detectar anticuerpos contra DV, JEV y TBEV. Para la detección de EEV y SV, aunque los anticuerpos de detección y captura fueron los mismos (1F1 y 4E11, respectivamente), los anticuerpos produjeron excelentes señales positivas. El epitope no fue definido; sin embargo, sospechamos que ambos anticuerpos se dirigen a la superficie de los viriones. A medida que un virio sale como, muchos con el mismo epítope aparecen, por lo tanto, no se produjo ninguna interferencia utilizando el mismo anticuerpo en el ensayo en forma de sándwich de doble anticuerpo. Actualmente, la disponibilidad de anticuerpos adecuados para un ensayo diagnóstico en formato de matriz es un problema importante. En el futuro, con un número creciente de anticuerpos adecuados, especialmente anticuerpos específicos contra Flavivirus, este ELISAarray podría ser capaz de probar más patógenos y ser de mayor uso potencial. Para hacer el ensayo más susceptible a la detección de múltiples virus, el protocolo de ensayo fue optimizado. Además del tampón de punción, la concentración de anticuerpos de captura y los diferentes métodos de inactivación del virus (calentamiento y β-propiolactona) también fueron comparados y evaluados. La inactivación del calor se realizó calentando los cultivos virales a 56°C durante 1 h, y la inactivación de β-propiolactona se realizó añadiendo β-propiolactona en los retenes mejor antigenicidad que el método de inactivación del calor. Así, se eligió el tratamiento de β-propiolactona como método de inactivación del virus. Un EL Se comparó el array ELISA con un ELISA convencional y se confirmó que la ventaja del array ELISA era evidente con especificidad comparable y mayor sensibilidad que ELISA. El tiempo requerido para el array ELISA es significativamente menor que para el array ELISA convencional (4 h frente a un mínimo de 6 h, respectivamente). Además, se requiere menos IgG para la impresión que para el recubrimiento de placas ELISA. Recubrimiento de un solo pozo en placa microtitular requiere 100 μl de una solución anticuerpo de 1 μg/ml, lo que equivale a 100 ng de IgG. Para el array ELISA, sólo se requiere 30 nl de una solución anticuerpo de 50 μg/ml para cada punto, lo que equivale a 1,5 ng de IgG. Con las características de facilidad de uso, sensibilidad, especificidad y precisión, el array ELISA sería ampliamente aceptado
|
¿Cómo se validó el ensayo ELISA-array?
| false
| 3,013
|
{
"text": [
"using cultured viruses and inoculated chicken eggs with patient sera"
],
"answer_start": [
3618
]
}
|
utilizando virus cultivados y huevos de pollo inoculados con sueros de paciente
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
En 2010, ¿cuántos casos de tuberculosis se estimaron en China?
| false
| 3,014
|
{
"text": [
"108 per 100,000"
],
"answer_start": [
1869
]
}
|
108 por 100.000
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cuál es la población de la provincia de Shandong?
| false
| 3,015
|
{
"text": [
"94 million"
],
"answer_start": [
2484
]
}
|
94 millones
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cuál era el propósito de este estudio?
| false
| 3,016
|
{
"text": [
"estimate the TB prevalence in Shandong"
],
"answer_start": [
2837
]
}
|
estimar la prevalencia de TB en Shandong
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cuál era el rango de edad de las personas encuestadas?
| false
| 3,017
|
{
"text": [
"15 years old or above"
],
"answer_start": [
3026
]
}
|
15 años o más
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cómo se diseñó la encuesta?
| false
| 3,018
|
{
"text": [
"in accordance with WHO recommendations"
],
"answer_start": [
3393
]
}
|
de conformidad con las recomendaciones de la OMS
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Era el tamaño de la muestra?
| false
| 3,019
|
{
"text": [
"52500"
],
"answer_start": [
3532
]
}
|
52500
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cómo se seleccionaron los clusters?
| false
| 3,020
|
{
"text": [
"A stratified multi stage random sampling"
],
"answer_start": [
3841
]
}
|
Muestreo aleatorio multietapa estratificado
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cuántas personas estaban en un grupo comunitario?
| false
| 3,021
|
{
"text": [
"1250 to 1750"
],
"answer_start": [
4236
]
}
|
1250 a 1750
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Quién fue excluido del estudio?
| false
| 3,022
|
{
"text": [
"Military barracks and prisons"
],
"answer_start": [
4627
]
}
|
Cuarteles militares y cárceles
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cuándo se realizó el estudio?
| false
| 3,023
|
{
"text": [
"March to June 2010"
],
"answer_start": [
4731
]
}
|
Marzo a junio de 2010
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Quién dirigió el estudio?
| false
| 3,024
|
{
"text": [
"clinicians, public health doctors, radiologists, laboratory technicians and nurses"
],
"answer_start": [
4780
]
}
|
clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Qué medio se utilizó para recoger las muestras de esputo?
| false
| 3,025
|
{
"text": [
"Löwenstein-Jensen medium"
],
"answer_start": [
6549
]
}
|
Medio Löwenstein-Jensen
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cuál fue la tasa de respuesta para el estudio?
| false
| 3,026
|
{
"text": [
"95% to 97%"
],
"answer_start": [
9615
]
}
|
95% a 97%
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cuál fue la edad media de un participante del estudio?
| false
| 3,027
|
{
"text": [
"46 years"
],
"answer_start": [
9776
]
}
|
46 años
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cuál fue la tasa de prevalencia en Shandong en 2010 para los casos positivos de tuberculosis en esputo?
| false
| 3,028
|
{
"text": [
"22.1"
],
"answer_start": [
12601
]
}
|
22.1
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cuál fue el hallazgo más llamativo del estudio sobre pacientes con tuberculosis?
| false
| 3,029
|
{
"text": [
"a large proportion of TB patients did not present consistent cough"
],
"answer_start": [
14313
]
}
|
una gran proporción de pacientes con tuberculosis no presentó tos consistente
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cuántos casos de pacientes con tuberculosis positiva al esputo no tuvieron tos persistente?
| false
| 3,030
|
{
"text": [
"45%"
],
"answer_start": [
14655
]
}
|
45%
|
1,557
|
Cambios en la prevalencia de la tuberculosis pulmonar: evidencia de la encuesta de población de 2010 en una populosa provincia de Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b5b8b7e74cf51922505Autores: Wei, Xiaolin; Zhang, Xiulei; Yin, Jia; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRON: Este documento informa de los resultados de la El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de TB en la provincia en 2010 en comparación con la encuesta de 2000; y comparar el rendimiento de casos de TB de diferentes abordajes de búsqueda de casos.MÉTODOS: Se realizó una encuesta transversal basada en la población mediante muestreo aleatorio multietapa. En la encuesta participaron 54.279 adultos con una tasa de respuesta del 96%. Los médicos entrevistaron y clasificaron a los participantes como presuntos casos de TB si presentaban tos persistente, rayos X torácicos anormales (CXRAY) o ambos. Se recogieron tres especímenes de esputo de todos los casos sospechosos y se enviaron para microscopía y cultivo. RESULTADOS: La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente fue de 34 por 100.000 en adultos en Shandong en 2010. En comparación con la encuesta de 2000, la prevalencia de TB disminuyó en un 80%. El 53% de los casos Más del 50% de los casos de tuberculosis se encontraban entre los más de 65 años. CONCLUSIONES: La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se redujo significativamente en comparación con el año 2000. La encuesta planteó desafíos para identificar casos de tuberculosis sin síntomas claros. Texto: China, con una prevalencia estimada de todos los casos de tuberculosis de 108 por 100.000 en 2010, tiene la segunda carga de tuberculosis más alta del mundo, representando el 13% de todos los casos en todo el mundo [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que China había alcanzado los objetivos de éxito en el tratamiento del 85% para 1993 y la tasa de detección de casos del 70% para 2005 [2]. Las encuestas nacionales de prevalencia de tuberculosis se llevaron a cabo en China en 1979, China en 1990, China en 2000, y 2010 [4]. Los resultados de la encuesta proporcionan estimaciones más precisas de las tasas de prevalencia de tuberculosis que las estimaciones de la OMS y pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que China Se trata de una provincia relativamente desarrollada con un PIB per cápita 1,6 veces el promedio nacional en 2010 [5]. La tasa de prevalencia de la TB en Shandong fue menor que la tasa media de China en 2000 [3]. En las encuestas de 2000 y 2010 se tomaron muestras representativas de la población en Shandong utilizando métodos similares. El objetivo del estudio fue estimar la prevalencia de la TB en Shandong con base en la encuesta de 2010, y comparar los resultados de las dos encuestas transversales. La población objetivo de la encuesta de prevalencia de la TB fue la población de 15 años o más que había vivido en los grupos seleccionados durante más de 6 meses. Se realizó una encuesta transversal basada en la población, utilizando el método de muestreo aleatorio multietapa. La encuesta utilizó los mismos métodos de muestreo que la encuesta nacional de China en 2010, que fue similar a los métodos de muestreo utilizados en 2000 [6]. El diseño de las encuestas estuvo de acuerdo con las recomendaciones de Se calculó el tamaño de la muestra de 52500 adultos (de 15 años de edad), en 35 conglomerados, con base en la detección de un cambio del 20% en la tasa de prevalencia de casos positivos de citología de tuberculosis en comparación con la tasa de la encuesta de 2000 (95 por 100.000), con una probabilidad superior al 95% y el 95% de potencia, con una tasa de respuesta del 90% de los participantes [9]. Se utilizó un muestreo aleatorio estratificado en varias etapas para seleccionar los 35 conglomerados dentro de 17 prefecturas de la provincia de Shandong. El número de conglomerados se asignó al azar en proporción a la población provincial en los niveles de prefectura, condado/distrito y municipio. Se definió un conglomerado como una comunidad (un pueblo en la zona rural o una comunidad residente en una zona urbana) con una población de 1250 a 1750 adultos (es decir, los de 15 años o más). Si la comunidad contenía menos de Si la comunidad o comunidades combinadas que contenían más de 1750 adultos, seleccionamos aleatoriamente los hogares y luego incluimos a todos los adultos en el hogar para la encuesta hasta que el número total de adultos seleccionados llegó a 1750. Se excluyeron los cuarteles militares y las prisiones ubicadas en el grupo [7]. La encuesta fue realizada de marzo a junio de 2010 por equipos de encuesta integrados por médicos clínicos, médicos de salud pública, radiólogos, técnicos de laboratorio y enfermeras. Se utilizó los medios de comunicación locales para promover el conocimiento de la encuesta. Los trabajadores comunitarios realizaron un censo casa por casa para actualizar la base de datos de residentes, informar a los participantes de la encuesta y obtener el consentimiento informado. El estudio no incluyó a niños menores de 15 años. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de 16 años o más. Mientras que de los de 15 años se obtuvieron consentimientos informados por escrito de sus padres o tutores. Todos los documentos fueron almacenados Se obtuvieron aprobaciones éticas para el estudio y los procedimientos de consentimiento de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Chest de Shandong (número de registro NIHIRB00006010), quienes aceptaron participar en la encuesta fueron invitados al dispensario de TB del condado, donde completaron una consulta con un médico de TB clínico capacitado sobre cualquier síntoma sugestivo de TB, como tos persistente (durante dos semanas o más), hemoptisis, pérdida de peso y fiebre; todos los participantes recibieron una radiografía de tórax (CXRAY) que luego fueron revisados por un panel de radiólogos; aquellos con síntomas o películas CXRAY sugestivas de TB fueron clasificados como presuntos casos de TB; todos los casos sospechosos fueron solicitados para producir tres muestras de esputo, una en el momento de la consulta, otra en la noche y la tercera en la madrugada del día siguiente. Los sospechosos identificados completaron un cuestionario adicional sobre su situación socioeconómica, su estado de tabaquismo y la presencia de síntomas relacionados con la tuberculosis en los seis meses anteriores (tos, fiebre, pérdida de peso, dolor torácico y hemoptisis).Se realizaron frotis de esputo en dispensarios locales de tuberculosis.Todas las muestras de esputo se cultivaron utilizando el medio Löwenstein-Jensen en el laboratorio provincial en un plazo de 24 horas utilizando el transporte en cadena fría.Las muestras se excluyeron de la tuberculosis cuando se identificaron bacilos no tuberculosos del cultivo.Todas las muestras de esputo se realizaron estrictamente de acuerdo con la medida de control de calidad externa del laboratorio nacional de tuberculosis, que es coherente con la directriz de la encuesta de prevalencia de la tuberculosis de la OMS [7].La clasificación de la tuberculosis se realizó de acuerdo con la directriz nacional china de tuberculosis [10]. Los pacientes con citología de esputo positiva fueron clasificados como casos positivos de esputo; los pacientes con citología de esputo positivo o de cultivo fueron clasificados como casos bacteriológicos confirmados como esputo bacteriológico; aquellos con cultivo negativo con CXRAY anormal sugestivo de TB y excluidos de otras enfermedades por médicos y radiólogos fueron clasificados como CXRAY sugestivo de casos bacteriológicos negativos; por limitaciones de recursos no se aplicó la recomendación de agentes antimicrobianos de amplio espectro para confirmar el diagnóstico de casos negativos de TB [11]. Los casos recién diagnosticados fueron diferenciados de casos previamente diagnosticados mediante controles durante las entrevistas y contra el sistema de registro de TB; el diagnóstico inicial fue realizado por un grupo de médicos y radiólogos locales; posteriormente, muestras y películas de CXRAY de todos los casos sospechosos y confirmados fueron reevaluados por un grupo de Las películas de CXRAY del 100% de las que fueron calificadas como anormales y las muestras aleatorias de 10% de las que fueron calificadas como normales fueron transferidas para lectura independiente. El equipo de laboratorio provincial examinó aleatoriamente una diapositiva de las tres muestras de casos positivos de esputo, las tres muestras de casos de TB sugerentes de CXRAY y seleccionó aleatoriamente el 10% de los casos no TB. Se calcularon estimaciones de prevalencia de los casos positivos de esputo, confirmados bacteriológicamente y todos los casos de TB. En todos los análisis se utilizaron ponderaciones de población para ajustar el efecto de diseño de muestreo multietapa estratificado [8]. Los resultados de la encuesta en 2010 y 2000 se estandarizaron con las estructuras de edad de la población del censo de China en 2010. La encuesta de prevalencia de TB de 2000 incluyó todos los grupos de edad [12]. El método recomendado por Se realizó el análisis de subgrupos en género, grupos de edad y residencia urbana/rural, se calculó la tasa de identificación de casos como el número de casos identificados por un método de cribado en todos los casos sospechosos encontrados por el método, se calcularon los rendimientos de la consulta sintomática y CXRAY como proporción del número total de casos confirmados bacteriológicamente, se seleccionaron 17 conglomerados urbanos y 18 conglomerados rurales, con una población total de 89.093, de los cuales 56.671 fueron elegibles para la encuesta (Figura 1 ), la tasa de respuesta osciló entre el 95% y el 97% en diferentes conglomerados. 54.279 participantes asistieron a la consulta clínica y fueron examinados por CXRAY, de los cuales el 47% eran varones; la edad promedio fue de 46 años con 14% de 65 años y se encontraron un total de 572 casos sospechosos de tuberculosis De estos, 264 (46%) fueron identificados en base a anomalías CXRAY, 228 (40%) se basaron en tos persistente, 80 (14%) se basaron en ambos, la encuesta diagnosticó 172 nuevos casos, incluyendo 19 nuevos casos confirmados bacteriológicamente (incluyendo 11 casos positivos de esputo y cultivo, y 8 casos negativos de esputo pero positivos de cultivo) y 153 casos bacteriológicos sugerentes CXRAY. La encuesta también identificó 11 casos existentes registrados en el programa nacional de TB. Además, la encuesta encontró cuatro casos con cultivo positivo de bacilos de no tuberculosis, y los excluyó de los pacientes de TB. Todos los participantes de la encuesta fueron examinados por primera vez por síntomas y CXRAY. Aquellos que tenían síntomas de tos o hemoptisis consistentes, o anomalías CXRAY fueron examinados por frotis y cultura. Las tasas de identificación de casos nuevos confirmados bacteriológicamente de los casos sospechosos fueron significativamente mayores con CXRAY como herramienta primaria (Figura 1, 3,8%, P = 0,012) y aumentaron tanto la pantalla de síntomas de tos persistente como la CXRAY (10%, P < 0,001) en comparación con la pantalla de síntomas solo (0,4%); se observó el mismo patrón de tasa de identificación de casos en los casos positivos de esputo (7,5%, 1,9% y 0% respectivamente); la proporción de casos confirmados bacteriológicamente no fue significativamente mayor entre los casos confirmados bacteriológicamente en comparación con otros sospechosos (P = 0,565); solo la consulta sintomática identificó 308 sospechosos, incluyendo 6 (1,9%) TB positiva de frotis de esputo y 9 (2,9%) TB confirmada bacteriológicamente; entre los 344 sospechosos con anomalías CXRA El rendimiento de los casos confirmados bacteriológicamente fue del 47,4% por consulta de cribado y del 94,7% por CXRAY. En la población de más de 65 años, la consulta de síntomas y la CXRAY identificaron 174 y 182 casos sospechosos respectivamente, lo que arrojó 5 (2,9%) y 9 (4,9%) de casos confirmados bacteriológicamente. Los rendimientos de los casos confirmados bacteriológicamente fueron del 55,6% por consulta de síntomas y del 100% por CXRAY entre los más de 65. De los 512 casos sospechosos que completaron el cuestionario adicional, el 42% eran agricultores y el 31% eran fumadores actuales (Tabla 1). De los diez casos confirmados bacteriológicamente que no presentaron tos persistente en la encuesta de prevalencia, uno tosió durante dos días, uno tuvo dolor torácico y los otros ocho no presentaron síntomas de TB en los últimos seis meses. La tasa bruta de prevalencia en Shandong en 2010 de casos positivos de esputo fue de 22,1 (IC 95%: 9,6-34,6), casos confirmados bacteriológicamente fue de 36,8 (IC 95%: 17,8-55,8), y todos los casos fueron de 337,1 (IC 95%: 254,1-420,0) por 100.000 en población adulta (Tabla 2 ). Las tasas ajustadas de prevalencia de toda la población en Shandong fueron de 17,8 (IC 95%: 8,3-17,5), 27,8 (IC 95%: 14,8-28.0) y 239,4 (IC 95%: 179,9-298,9) por 100.000 en 2010. Se observó una notable disminución de 82,0%, 80,2% y 31,4% en las tasas de prevalencia de esputo positivo, confirmado bacteriológicamente, y en todos los casos, respectivamente, en comparación con las tasas ajustadas en 2000 [12]. Se observaron grandes descensos en los hombres de 40 a 65 años y en las mujeres de más de 60 años (Figura 2). Las tasas de prevalencia ajustada en la población adulta fueron 21,4 (IC 95%: 10,0-32,8), 33,5 (IC 95%: 17,8-49,2) y 285,8 (IC 95%: 254,2-356,4) para los casos positivos de esputo, casos confirmados bacteriológicamente y todos los casos, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en las tasas de prevalencia ajustada de tuberculosis entre hombres y mujeres de más de 65 años y de 15 a 64 años, en las zonas rurales y urbanas (Tabla 2, P < 0,001 Las proporciones entre hombres y mujeres fueron 5,5 en casos positivos de esputo y 2,8 en casos confirmados bacteriológicamente, mientras que las proporciones aumentaron a 6,0 y 4,1 respectivamente, entre los mayores de 65 años; la mayoría de los pacientes con TB, 54,5% en casos positivos de esputo y 47,3% en casos confirmados bacteriológicamente, fueron de 65 años o más; la proporción entre mayores de 65 años y 15 a 64 años fue de 8,4 en casos positivos de esputo y 5,9 en casos confirmados bacteriológicamente; la proporción entre zonas rurales y urbanas fue de 2,7 en casos positivos de esputo y 4,8 en casos confirmados bacteriológicamente; el hallazgo más llamativo fue que una gran proporción de pacientes con TB no presentó tos consistente; el hallazgo pasivo de casos es la práctica habitual en países en desarrollo donde se realiza la microscopía de esputo para identificar casos de Una gran proporción de los casos de tuberculosis pueden no ser detectados utilizando este método como 53% de los casos confirmados bacteriológicamente y 45% de los casos positivos de esputo en este estudio no tuvieron tos persistente pero fueron identificados a través de CXRAY anormal. Casi la mitad de los casos confirmados bacteriológicamente no reportaron síntomas en los últimos seis meses. Este hallazgo, aunque inicialmente sorprendente, es consistente con reportes de Vietnam (47% de los casos confirmados bacteriológicamente no presentaban tos persistente) [14], Myanmar (38%) y Etiopía (48%) [13]. CXRAY fue sensible en la detección de casos de tuberculosis, ya que los rendimientos de casos confirmados bacteriológicamente fueron mucho más altos por CXRAY en comparación con la detección de síntomas, como se informó en Vietnam [15] y algunos entornos de alta prevalencia del VIH [16, 17]. Nuestros hallazgos sugieren que la estrategia de búsqueda de casos utilizando CXRAY seguido de esputo o cultivo como las pruebas primarias y secundarias de cribado podría ser más efectiva, especialmente entre la población de más de 65 años, ya que los rendimientos fueron mayores en más de 65 años en comparación con la Tabla 2 Prevalencia de casos de TB positivo de esputo, casos de TB confirmados bacteriológicamente y todos los casos en Shandong, China, 2010 No hay población. Aunque usar CXRAY para examinar a todos no es factible, puede ser utilizado en exámenes físicos de ancianos de rutina. El paquete de salud pública de China ahora cubre CXRAY gratis para ancianos, así como exámenes corporales anuales de empleados proporcionó CXRAY gratuito. En esta encuesta, sólo un paciente positivo de esputo había sido detectado y tratado por el programa nacional, aunque se realizó una consulta clínica específica para identificar a cualquier paciente que haya sido diagnosticado y tratado Esto puede reflejar la diferencia entre el enfoque de búsqueda de casos activos en la encuesta y el enfoque de búsqueda de casquillo pasivo en la práctica; sin embargo, indicó que una gran proporción de casos de TB confirmados bacteriológicamente no son atendidos por el programa nacional de TB. Otro cambio notable es la fuerte disminución de la proporción de casos positivos de esputo, que representó el 30,5% de todos los casos en la encuesta de 2000, pero se redujo al 6,6% en la encuesta de 2010. La proporción de casos de esputo notificados de todos los casos de TB en Shandong también disminuyó del 80,9% en 2005 al 64,6% en 2010 [19]. La tasa de prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente se ha reducido en un 80% en la última década en Shandong, en comparación con una disminución nacional del 45% (de 216/ 100.000 en 2000 a 119/ 100.000 en 2010] [4]. La rápida disminución de la prevalencia de casos confirmados bacteriológicamente en la última década puede atribuirse al fortalecimiento del sistema de salud pública de China tras el brote de síndrome respiratorio agudo grave en 2003 [2]. Otra razón puede deberse a la mejora de la notificación de casos de tuberculosis en el sistema de notificación de enfermedades transmisibles en línea, y a la mejora de la colaboración entre los hospitales públicos y los dispensarios de tuberculosis [20]. Otros factores como el desarrollo económico social también pueden haber desempeñado un papel importante en la reducción de la prevalencia de la tuberculosis, como se encontró en un estudio de las tendencias de las tasas de notificación de la tuberculosis en 134 países [21]. La tasa de prevalencia ajustada de casos confirmados bacteriológicamente en Shandong fue inferior a las estimaciones de la OMS para China en 2010 [1]. Una de las razones es que los resultados de las encuestas de prevalencia se basan en el hallazgo de casos activos, mientras que las estimaciones de la OMS se basan en las tasas de notificación de los casos pasivos. Se necesita una reevaluación de la prevalencia de tuberculosis reportada en China basada en la encuesta reciente. CXRAY sugiere que los casos bacteriológicos negativos pueden ser casos de tuberculosis bacteriológicamente negativos si tenían algún síntoma de tuberculosis, mientras que algunos pueden ser causados por un frotis o cultivo subóptimo. Como se informó en encuestas anteriores de China [3, 22], incluyendo estos casos como casos de tuberculosis pueden resultar en una sobreestimación de todos los casos pulmonares [23]. La encuesta reveló que más de la mitad de los pacientes con tuberculosis tenían 65 años o más en Shandong, mientras que los más de 65 años tenían más probabilidades de presentarse con CXRAY anormal y tos persistente. Tendencias similares se han Estas altas tasas pueden reflejar las tasas de tuberculosis más altas en el pasado y la disminución de la inmunidad en los más de 65 años.Cómo tratar a los ancianos con tuberculosis y otras complicaciones como la diabetes sigue siendo un desafío continuo en China y entornos similares.Los resultados de la encuesta pueden generalizarse a la población de Shandong de 94 millones de habitantes o entornos internacionales similares con ingresos medios y niveles medios de prevalencia de la tuberculosis.Los patrones de la epidemia de tuberculosis encontrados en Shandong, es decir, la proporción de pacientes con síntomas, proporción entre zonas urbanas y rurales, hombres y mujeres, fueron similares a los encontrados en la encuesta nacional [4].Sin embargo, las tasas de prevalencia no pueden extrapolarse a las provincias occidentales de China con una mayor prevalencia de tuberculosis.Por razones logísticas, la población elegible no incluyó a los adultos que permanecieron en los grupos muestreados menos de 6 meses, lo que fue la misma práctica en la encuesta de 2000.Sin embargo, los migrantes a La encuesta no recopiló indicadores socioeconómicos, estado de tabaquismo y estado de VIH de todos los participantes, por lo que no se dispone de comparaciones entre los casos de tuberculosis y todos los pacientes no tratados con TB. Sin embargo, la prevalencia del VIH en Shandong China es inferior al 0,01%, y no alteraría significativamente la tasa de prevalencia de la TB. Además, la encuesta no evaluó la TB infantil y la TB pulmonar extra. Las discusiones sobre el uso de CXRAY como herramienta de cribado fueron en el aspecto técnico, pero no en el lado de los costos, ya que no realizamos ningún análisis de la relación costo-eficacia ni la voluntad social de pagar por tal estrategia en entornos similares. Este estudio ha demostrado que la prevalencia de TB confirmada bacteriológicamente en Shandong ha disminuido sustancialmente en la última década. Es importante destacar que la mayoría de estos casos no se presentaron con tos persistente y la proporción de Se recomiendan estudios adicionales para evaluar la viabilidad de la adopción de CXRAY en los servicios de salud existentes para detectar casos de tuberculosis y la relación costo-eficacia de dicha intervención.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
|
¿Cuántos pacientes de tuberculosis en Shandong tenían más de 65 años?
| false
| 3,031
|
{
"text": [
"over half"
],
"answer_start": [
18779
]
}
|
más de la mitad
|
1,565
|
Diseño, síntesis, evaluación y termodinámica de un piridilimidazo substituido[1,5-a]Derivados de la piridina como inhibidores de la proteasa de la cisteínahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3734177/SHA: ee8483f8f2cc5fe38be4e5651eae3af9d0bb8220bAutores: Khan, Mohd Sajid; Baig, Mohd Hassan; Ahmad, Saheem; Siddiqui, Shapi Ahmad; Srivastava, Ashwini Kumar; Srinivasan, Kumar Venkatraman; Ansari, Irfan A. Fecha: 2013-08-05DOI: 10.1371/journal.pone.0069982Licencia: cc-byResumen: Las proteasas de cisteína de la familia de las papaínas son una de las nuevas estrategias en el desarrollo de quimioterapia para una serie de enfermedades. Los inhibidores de la proteasa de cisteína nuevos derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina que representan la clase farmacológicamente importante de compuestos se reportan aquí por primera vez. Los derivados fueron inicialmente diseñados y analizados en silico mediante estudios moleculares de acoplamiento contra la papaína para explorar el posible modo de acción. La interacción molecular entre los compuestos y la proteasa de cisteína (papain) se encontró muy similar a las interacciones observadas con el respectivo inhibidor epóxido (E-64c) de la papaína. Posteriormente, los compuestos fueron sintetizados para validar su Cuando se caracterizan cinéticamente, estos compuestos muestran sus valores de K(i) y IC(50) en el rango de 13,75 a 99,30 μM y 13,40 a 96,50 μM, respectivamente. Los estudios termodinámicos sugieren su unión con la papaína impulsada hidrofóbica y entrópicamente. Estos inhibidores también inhiben el crecimiento de diferentes tipos clínicamente importantes de bacterias Gram positivas y Gram negativas con valores MIC(50) en el rango de 0,6–1,4 μg/ml. Basados en la regla de Lipinski de Cinco, también proponemos estos compuestos como potentes profármacos antibacterianos. El compuesto antibacteriano más activo fue 1-(2-piridil)-3-(2-hidroxifenil)imidazo[1,5-a]piridina (3a). Texto: Los inhibidores de la proteasa cisteína (IPC) han ganado considerable atención en las últimas dos décadas y muchas clases de compuestos están actualmente en ensayos clínicos humanos para una serie de enfermedades. El interés en las proteasasas de la familia de la papaína como objetivos quimioterapéuticos se deriva del reconocimiento de que son críticos para el ciclo de vida o patogenicidad de muchos microorganismos. Las proteasas de la cisteína de Streptococcus sp. (streptopain) [1], Staphylococcus sp. (staphopain) [2], Plasmodium falciparum (falcipain-1, -2, y -3) y Trypanosoma cruzi (cruzipain) [3] son algunos de los miembros más estudiados de la familia de la papaína que se ha informado que están relacionados con la gravedad de la infección y diversas condiciones patológicas causadas La activación de la vía kallikreina-kinina, que podría ser activada por más de dieciséis proteasas bacterianas, es un mecanismo que algunos patógenos explotan para asegurar que hay un suministro de nutrientes al lugar de la infección por el aumento de la permeabilidad vascular. Esto se ha demostrado que ocurre en infecciones con varias especies microbianas, incluyendo Pseudomonas, Serratia, Clostridium, Cándida, Bacteroides, Porphyromonas y Staphylococcus sp. [4]. Muchas bacterias secretan varias proteasas inespecíficas, por ejemplo Pseudomonas, Serratia, Streptococcus, Staphylococcus y Bacteroides sp. tienen potentes proteasases metalo-, cisteína y serina con amplia gama de actividades [5]. El papel crítico de las proteasas bacterianas en la virulencia se demostró con éxito al eliminar el gen proteasaencoding en P. gingivalis [6]. La superfamilia de proteínas de cistatina recientemente descrita comprende inhibidores de la proteasa eucariótica y procariótica [7]. Cistatinas humanas C, D y S, cistatinas de rata A y S, cistatina de pollo y oriza cistatina inhiben la replicación de ciertos virus y bacterias [8] aunque todavía no se ha demostrado directamente que estos efectos se deban a la capacidad inhibitoria de proteasa de las cistatinas [9]. El papel clave de las proteasasasas de cisteína en infecciones microbianas, junto con la relativa falta de redundancia en comparación con los sistemas mamíferos, ha hecho que las proteasas microbianas sean objetivos atractivos para el desarrollo de Los sistemas de anillo de imidazopiridina representan una importante clase de compuestos no sólo por su interés teórico, sino también desde el punto de vista farmacológico. Se ha demostrado que poseen una amplia gama de actividades farmacológicas útiles [12] incluyendo antigástrico, antisecretario, anestésico local, antiviral, antiansiedad, antibacteriano, antifúngico, antihelmíntico, antiprotozoario, anticonvulsivo, gastrointestinal, antiulcer (Zolmidina), ansiolítico (Alpidem), hipnótico (Zolpidem) e inmunomodulador [13]. La naturaleza y la posición de los substituentes sobre la moiedad piridinica influyen en estas actividades farmacológicas. Estas estructuras heterocíclicas de imidazopiridina forman parte del esqueleto de alcaloides naturales, agentes bloqueantes neuromusculares [14], inhibidores reversibles de las enzimas H +, K + -ATPasa con una potente actividad antisecretaria, y se sabe que son hipnóticos sedantes del sistema nervioso [15]. En este estudio, hemos propuesto cinética y termodinámicamente caracterizar 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina como un potente y novedoso inhibidor de la proteasa cisteína que también actúa como agentes antibacterianos. La estructura cristalina de la papaína se extrajo del Protein Data Bank (código PDB: 1PE6) [16]. Se eliminaron todas las moléculas de agua y heteroatomos y se añadieron átomos de hidrógeno a la proteína. Se aplicó el campo de fuerza CharMm [17] y la estructura fue sometida a minimización de energía para 1000 pasos utilizando el método de descenso más empinado. Las estructuras químicas de todos los compuestos sintetizados fueron generadas utilizando quimdraw y posteriormente convertidas en formato 3D utilizando CORINA. Se realizó una serie de experimentos de acoplamiento con todas las energías de unión diseñadas de 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina contra papaína utilizando AutoDock Tools 4.0 [18] para posibles actividades inhibidoras de la cisteína-proteasa. Los compuestos fueron seleccionados sobre la base de sus energías de unión y aquellos que reflejan una buena afinidad de unión fueron analizados en la plataforma silica. Como parámetro para el acoplamiento molecular, se utilizó el algoritmo genético Lamarckian, una combinación entre el algoritmo genético y el algoritmo local de búsqueda Pseudo-Solis y Wets. Se generó una caja de cuadrícula de 60660660 Å alrededor del sitio activo de papaína, asegurándose de que estos inhibidores pueden girar libremente dentro de la cuadrícula. El número de carreras de acoplamiento se fijó en 10. Cada acoplamiento se repitió cinco veces, teniendo al final un total de 50 carreras de acoplamiento, para comprobar la precisión de los resultados. Los complejos finalmente obtenidos fueron visualizados posteriormente usando PyMol [19]. El trabajo fue autenticado posteriormente en el laboratorio húmedo después de su análisis detallado en la plataforma de silico. Los derivados diseñados fueron filtrados por la ''Regla de cinco'' de Lipinski que establece los criterios para propiedades similares a las drogas. La semejanza de drogas es una propiedad que se utiliza más a menudo para caracterizar compuestos de plomo novedosos [20]. De acuerdo con esta regla, se espera mala absorción si MW.500, log P.5, donantes de enlace de En las propiedades de absorción, distribución, metabolismo y excreción de silico (ADME) de estos derivados también se predijeron utilizando las siguientes herramientas bioinformáticas en línea. N http://www.organical-chemistry.org. N http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal. py? Form = admetox N https://secure.chemsilico.com/pages/submit.phpEl estudio anterior nos dio una idea sobre la existencia de posibles propiedades mutágenas y tumorígenas en compuestos sintetizados.El resultado obtenido nos ayudó a eliminar los compuestos sintetizados para su uso posterior como leads potentes. A partir de los resultados de los estudios de acoplamiento, se sintetizaron diez derivados de 1piridilimidazo[1,5-a]piridina según Siddiqui et al., 2006 [22] que se denominan así: 1- La capacidad de los derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina para inhibir las proteasasas de cisteína se probó utilizando papaína como enzima modelo. La actividad proteolítica de las mezclas de reacción se determinó utilizando Bz-DL-Arg-pNA como sustrato cromogénico [23]. A las soluciones de papaína activa (concentración final: 0,05 mM) se añadieron soluciones concentradas de los diferentes derivados a concentraciones finales de 0,2 mM. Después de la incubación durante 30 min a 37uC, se añadió la solución de sustrato y después de una incubación posterior durante 20 min, la reacción se interrumpió mediante la adición de ácido triclórico (TCA) al 5% acidificado con 2,25% de HCl y la absorción de la mezcla de reacción se determinó a una longitud de onda de 410 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad). El mismo procedimiento se utilizó a 32uC y 42uC para estudios termodinámicos. Los parámetros cinéticos para la hidrólisis del sustrato se determinaron mediante la medición de la tasa inicial de actividad enzimática. La constante de inhibición K i fue determinada por el método Dixon [24] y también por la ecuación Lineweaver-Burk. El valor de K m se calculó a partir de la ecuación de doble recíproco mediante la incorporación de los Para el análisis cinético y las determinaciones constantes de velocidad, los ensayos se realizaron por triplicado, y el valor promedio fue considerado a lo largo de este trabajo. Se utilizó la dependencia de temperatura de las constantes de inhibición para determinar los parámetros termodinámicos. Los cambios en la entalpía (DH) se determinaron a partir de las parcelas de Van't Hoff mediante el uso de la ecuación, donde DH es entalpía cambio, R es constante de gas, DS es entropía cambio y T es la temperatura absoluta. El cambio entropía se obtuvo a partir de la ecuación.El ensayo se realizó a diferentes temperaturas (32uC, 37uC, 42uC) calculando varios K i de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina derivados con papaína como enzima modelo.El método de difusión en disco [25] se utilizó para la evaluación antibacteriana preliminar de los derivados El MIC 50 de estos derivados, que mostró inhibición en las pruebas preliminares, fue determinado además por la técnica de placa de microtitro utilizando el método de microdilución [26]. En resumen, las cepas bacterianas (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii)) fueron cultivadas y diluidas hasta 2610 5 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml en tampón de fosfato sódico (SPB) que contenía 0,03% de caldo Luria-Bertani (LB). Los derivados sintetizados fueron disueltos en DMSO y su dilución en serie se realizó en 50 mL de medio LB en placa de microtitro de 96 pocillos para lograr las concentraciones requeridas (0,1-10 mg/ml) con inó El DMSO fue tomado como control negativo y Ceftriaxona y el clotrimazol fueron tomados como control positivo. Después de la incubación a 37uC durante la noche, los MIC fueron tomados como la concentración inhibidora más baja en la que se inhibió el crecimiento bacteriano. Se calculó el promedio de tres valores y fue el MIC para el material de prueba y cepa bacteriana. Para el método de recuento de placas de agar [27], 25 mL de alícuotas de bacterias a 1610 5 UFC/ml en SPB conteniendo 0,03% de caldo LB fueron incubados con 25 mL de compuestos diluidos durante 2 h a 37uC. Las mezclas de bacterias y compuestos se diluyeron en serie 10 veces con SPB y se plató en placas LB que fueron incubadas a 37uC de la noche a la mañana. Después de haber determinado los CMI, las cepas bacterianas de los pozos de la placa de microtitro sin crecimiento bacteriano visible fueron retiradas para subcultivo en serie de 2 ml en otra nueva placa de microtitro conteniendo 100 ml de caldo por pozo y posteriormente incubadas durante 24 h. La concentración más baja sin crecimiento visible fue definida como CMB [28], lo que indica la muerte del 99,5% del inóculo original. La absorción de cada pozo fue medida a una longitud de onda de 620 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad) y comparada con un vacío. Solvente (DMSO) fue utilizado como control negativo. Se realizaron tres réplicas para cada compuesto y el experimento se repitió dos veces. Las bacterias utilizan sus proteasas de cisteína para la patogeneidad como podría ser representado a partir de la estructura de homólogo Cif en Burkholderia pseudomallei (CHBP) que revela un pliegue tipo papaína y una tríada catalítica conservada Cys-His-Gln [29]. Se ha demostrado que los patógenos bacterianos tienen una actividad hidrolítica única como papaína para bloquear la progresión normal del ciclo celular huésped como el núcleo de una proteína de avirulencia (Avr) (AvrPphB) del patógeno vegetal Pseudomonas syringae, se asemeja a las proteasasasas de cisteína tipo papaína. La similitud de esta proteína AvrPphB con papaína incluye la tríada catalítica de Cys-98, His-212, y Asp-227 en el sitio Turk et al. han propuesto, sobre la base de estudios cinéticos y estructurales, que la papaína tiene siete subsitios en el sitio activo, pero sólo cinco subsitios son importantes que pueden unirse a un residuo de aminoácidos del sustrato [31]. Una variedad de intermedios se generan cuando la papaína reacciona con el sustrato o un inhibidor [2]. Al igual que las proteasasas de serina, las proteasasas de cisteína tienden a tener sitios activos relativamente poco profundos, expuestos a disolventes, que pueden acomodar segmentos cortos de sustrato/inhibidores de bucles proteicos (por ejemplo, a partir de inhibidores endógenos como las cistatinas) o hebras. Tipo de inhibición Ki (mM) IC 50 (mM) Compuesto no competitivo 13,7 13.4 unido a la proteasa con una combinación de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Como parte de nuestra investigación en el desarrollo de nuevos y eficientes inhibidores de la proteasa cisteína, diez derivados de la piridilimidazo [1,5a] piridina sustituida (3a-j) fueron diseñados y analizados principalmente sobre la base de sus energías de acoplamiento contra la papaína para dilucidar su posible modo de acción. Se encontró que estos compuestos eran inhibidores específicos de la proteasa cisteína, papaína y no mostraron inhibición contra otros tipos de proteasasasasas como la serina, aspártica o metalloproteasas. Son específicos para el clan CA de la proteasa cisteína y no mostraron ninguna inhibición significativa contra otros clanes de proteasasasasas Estos nuevos compuestos fueron concebidos sobre la base del conocimiento de la capacidad de una proteína para alterar su conformación para acomodar un ligando de unión y nos permitió comparar directamente las posiciones relativas del residuo en el bolsillo de unión. El estudio de acoplamiento molecular proporcionó la visión estructural sobre la unión de estos compuestos (3a-j) (Figura 1) dentro del sitio activo de papaína que consiste principalmente en una tríada catalítica de Cys 25, Sus 159 y Asp 175 [32]. Además, el papel de otros residuos presentes en el sitio activo de papaína, jugando un papel importante en el alojamiento de compuestos también se han revelado. Inicialmente, el acoplamiento se realizó con todos los compuestos diseñados (3a-j) contra papaína, una conocida enzima de proteasa cisteína y en este contexto, observamos resultados muy interesantes donde nuestros inhibidores propuestos (3a-j) aprovechan los residuos aromáticos e hidrofílicos haciendo una variedad de Aunque los compuestos 3e-j dieron resultados significativos cuando se acoplaron con papaína pero durante la evaluación de las propiedades antibacterianas en experimentos de laboratorio húmedos, dieron resultados insignificantes (datos no mostrados).Por lo tanto, sólo cuatro compuestos fueron considerados para discusión y otros experimentos como estudios cinéticos y termodinámicos para caracterizar a estos compuestos como potentes pro-inhibidores (3a-d). Los hallazgos del estudio anterior han demostrado que las interacciones moleculares entre los compuestos 3a-d y papaína fueron muy similares a las interacciones observadas para E-64c, un derivado del inhibidor epóxido natural (E-64c) (Figura 1 ) de proteasasasas de cisteína [31, 32], con papaína; especialmente con respecto a la unión de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas de los ligandos con residuos conservados en el sitio de unión catalítica ( Varios residuos de papaína participaron en interacciones hidrofóbicas con compuestos 3a-d, incluyendo Gln19, Cys25, Gly66 y Asp158. Las propiedades de piridina de compuestos 3a-d interactúan con el sitio S2 de papaína, que incluye (Tyr61, Asn64, Gly65 y Tyr67) aminoácidos (Figura 2 A-D). Los residuos activos del sitio que se encontró que son un agente clave en la interacción de compuestos dentro del sitio activo (principalmente a través de interacciones hidrofóbicas) fueron Cys25, Tyr61, His159 y Trp177, mientras que Trp177, Gln19 fueron encontrados para mí haciendo enlaces de hidrógeno sólo con el compuesto 3a. Además de estos muchos otros residuos también se encontraron involucrados activamente (Tabla 1). Además, las energías de unión para el compuesto 3a, 3b, 3c y 3d con papaína se encontraron en 26.12, 25.76, 26.84 y 25.62 Kcal/mol respectivamente, que estuvieron en gran acuerdo con nuestros experimentos de laboratorio húmedo; se discutirán más adelante (Tabla 1). Esto confirmó la exactitud de nuestro protocolo de acoplamiento. Puesto que, la energía de unión es una medida directa de la fuerza de interacción y nuestros compuestos 3a-d mostraron una unión más fuerte dentro del sitio activo de papaína en comparación con el inhibidor E-64c (DG: 24.04 Kcal/mol), por lo tanto, los resultados sugieren que estos derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina (3ad) podrían ser inhibidores potentes de papaína como proteasasas de cisteína. La interacción en silico de compuestos 3a-d con papaína, observada como se ha comentado anteriormente, fue validada con laboratorio húmedo Tabla 5. La predicción de compuestos antibacterianos como fármacos (http://www.organical-chemistry.org). Tabla 2). Curiosamente, las energías de unión observadas en silico para los compuestos 3a-d contra papaína se encontraron en gran concordancia (error estándar 62 Kcal/mol) con el valor de energía libre de unión (DG) observado durante los estudios termodinámicos ( Tabla 1 y 2). Del mismo modo, el cambio entalpía (DH) de la unión fue negativo mientras que el cambio entropía (DS) de la unión fue positivo que indicó la naturaleza exotérmica y entropica de la unión. Este patrón de dependencia de la temperatura es característico de la interacción hidrofóbica [33]. Como se discutió anteriormente que todos los compuestos (3a-d) fueron encontrados para interactuar con los residuos activos del sitio de papaína a través de interacciones hidrofóbicas en la mayoría de los casos durante los estudios de silico, lo mismo fue observado por el análisis de las parcelas de Van't Hoff para todos los inhibidores propuestos a tres temperaturas diferentes (32uC, 37uC y 42uC) en experimentos de laboratorio húmedo (Figura 3). Esto demuestra la importancia de estos tipos de interacciones en el posicionamiento de compuestos dentro del sitio activo. Por lo tanto, la termodinámica así como en el estudio de silico revela que las interacciones hidrofóbicas favorecen la unión de estos inhibidores propuestos con papaína como proteasasasas de cisteína. En resumen, los resultados anteriores de estudios de acoplamiento molecular y análisis termodinámico de compuestos 3a-d con papaína mostraron que estos compuestos tienen el potencial de ser inhibidores de la proteasa cisteína novedosos y únicos. En el estudio actual, la actividad inhibidora de la proteasa cisteína de derivados sintetizados de 1 piridilimidazo substituido[1,5-a] piridina (3a-d)] también se realizó contra la papaína y se observaron constantes de inhibición (K i ) para la citada enzima 13,70, 23,20, 90,00 y 99,30 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Además, los valores calculados de IC 50 fueron también de 13,40, 21,17, 94,50 y 96,50 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Excepto el compuesto 3b, el resto de los compuestos mostraron inhibiciones reversibles no competitivas, pero todos los compuestos, independientemente de los tipos de unión, mostraron interacción hidrofóbica y entrópicamente impulsada. Estos derivados (3a-j) fueron finalmente evaluados para sus actividades antibacterianas contra siete microbios clínicamente importantes (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii). Aquí, estamos mostrando los datos de sólo cuatro compuestos (3a-d) debido a sus resultados significativos (Tabla 4). Todos los compuestos siguieron estrictamente el patrón de actividad antiproteasa hacia el crecimiento bacteriano excepto P. vulgaris y E. coli en una instancia cada uno (Tabla 4). Dado que los compuestos 3c y 3d no tienen mucha diferencia en sus valores IC50 (3c-94.5 mM y 3d-96.5 mM) contra la proteasa de cisteína, papaína y por lo tanto en la actividad antibacteriana en todos los casos excepto uno. Puede ser aleatorio debido a tan cerca en valores IC50. Compuestos 3c y 3d están teniendo mucha diferencia en sus valores IC50 (3b-21.17 mM y 3c-94.5 mM) y mostraron patrón exacto para su actividad antibacteriana para todos los microbios excepto E. coli en un caso. Aunque E. coli contiene seis proteasasas de cisteína principales pero ninguno pertenece al clan CA de papaína. Se argumenta que estos compuestos también inhibieron las proteas de cisteína de otros clanes pero con baja eficacia. Dado que los derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina son un andamio absolutamente nuevo hacia los agentes antibacterianos y, por lo tanto, no se dispone de ningún compuesto estándar del mismo andamio. Así, Clotrimazol (1-[(2-clorofenil)(difenil)metil]-1H-imidazol), un derivado imidazol y Ceftriaxona (antibio de cefalosporina de tercera generación con actividad de amplio espectro frente a bacterias Gram positivas y Gramnegativas) se han utilizado como control positivo, mientras que DMSO se ha utilizado como control negativo. Se ha demostrado que todas las especies bacterianas mencionadas anteriormente secretan ciertas proteasasas de cisteína que desempeñan un papel muy importante en la patogeneidad de diferentes enfermedades causadas por estos microorganismos. Se observó que la concentración inhibitoria mínima (CMI) de compuestos (3a-d) (Tabla 4) frente a todas las bacterias probadas, excepto E. coli y P. vulgaris, estaba en gran acuerdo con sus respectivos valores constantes de inhibición (Ki)/IC 50 frente a la papaína (Tabla 3), lo que indica claramente que estos compuestos tienen el potencial de inhibir la papaína como las proteasasas de cisteína de estos patógenos. El coeficiente de partición (logP) es una medida bien establecida de la lipofilia del compuesto. La distribución de los valores de logP calculados (cLogP) de la mayoría de los fármacos en el mercado está en el rango de cero a cinco. Todos los compuestos estudiados excepto 3d, mostraron un buen acuerdo con los criterios establecidos para la predicción de un compuesto como fármaco potencial (Tabla 5). Todos los compuestos no muestran ninguna amenaza contra la evaluación del riesgo de toxicidad excepto el compuesto 3d que mostró una amenaza como efecto tumorógeno debido a la presencia de grupo de isobutilo. Entre todos los compuestos probados, el compuesto 3a fue el más potente cuyo MIC fue el más bajo de todos los compuestos probados y mostró una puntuación máxima de fármaco y valores positivos para la semejanza con el fármaco. En resumen, los resultados del presente estudio han establecido que los derivados piridilimidazo[1,5-a] de 1 sustituto podrían ser candidatos a inhibidores nuevos y potentes de papaína como las proteasasas de cisteína, que juegan un papel deletérgico en la progresión de diferentes enfermedades causadas por diversos microorganismos. Por lo tanto, este grupo de compuestos podría ser objeto de investigación futura para hacer frente a los desafíos con microorganismos resistentes que son una amenaza importante a nivel mundial.
|
¿Qué enzimas se han comunicado que están relacionadas con la gravedad de la infección y diversas condiciones patológicas causadas por microorganismos?
| false
| 3,041
|
{
"text": [
"cysteine proteases"
],
"answer_start": [
2276
]
}
|
proteasasas de cisteína
|
1,565
|
Diseño, síntesis, evaluación y termodinámica de un piridilimidazo substituido[1,5-a]Derivados de la piridina como inhibidores de la proteasa de la cisteínahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3734177/SHA: ee8483f8f2cc5fe38be4e5651eae3af9d0bb8220bAutores: Khan, Mohd Sajid; Baig, Mohd Hassan; Ahmad, Saheem; Siddiqui, Shapi Ahmad; Srivastava, Ashwini Kumar; Srinivasan, Kumar Venkatraman; Ansari, Irfan A. Fecha: 2013-08-05DOI: 10.1371/journal.pone.0069982Licencia: cc-byResumen: Las proteasas de cisteína de la familia de las papaínas son una de las nuevas estrategias en el desarrollo de quimioterapia para una serie de enfermedades. Los inhibidores de la proteasa de cisteína nuevos derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina que representan la clase farmacológicamente importante de compuestos se reportan aquí por primera vez. Los derivados fueron inicialmente diseñados y analizados en silico mediante estudios moleculares de acoplamiento contra la papaína para explorar el posible modo de acción. La interacción molecular entre los compuestos y la proteasa de cisteína (papain) se encontró muy similar a las interacciones observadas con el respectivo inhibidor epóxido (E-64c) de la papaína. Posteriormente, los compuestos fueron sintetizados para validar su Cuando se caracterizan cinéticamente, estos compuestos muestran sus valores de K(i) y IC(50) en el rango de 13,75 a 99,30 μM y 13,40 a 96,50 μM, respectivamente. Los estudios termodinámicos sugieren su unión con la papaína impulsada hidrofóbica y entrópicamente. Estos inhibidores también inhiben el crecimiento de diferentes tipos clínicamente importantes de bacterias Gram positivas y Gram negativas con valores MIC(50) en el rango de 0,6–1,4 μg/ml. Basados en la regla de Lipinski de Cinco, también proponemos estos compuestos como potentes profármacos antibacterianos. El compuesto antibacteriano más activo fue 1-(2-piridil)-3-(2-hidroxifenil)imidazo[1,5-a]piridina (3a). Texto: Los inhibidores de la proteasa cisteína (IPC) han ganado considerable atención en las últimas dos décadas y muchas clases de compuestos están actualmente en ensayos clínicos humanos para una serie de enfermedades. El interés en las proteasasas de la familia de la papaína como objetivos quimioterapéuticos se deriva del reconocimiento de que son críticos para el ciclo de vida o patogenicidad de muchos microorganismos. Las proteasas de la cisteína de Streptococcus sp. (streptopain) [1], Staphylococcus sp. (staphopain) [2], Plasmodium falciparum (falcipain-1, -2, y -3) y Trypanosoma cruzi (cruzipain) [3] son algunos de los miembros más estudiados de la familia de la papaína que se ha informado que están relacionados con la gravedad de la infección y diversas condiciones patológicas causadas La activación de la vía kallikreina-kinina, que podría ser activada por más de dieciséis proteasas bacterianas, es un mecanismo que algunos patógenos explotan para asegurar que hay un suministro de nutrientes al lugar de la infección por el aumento de la permeabilidad vascular. Esto se ha demostrado que ocurre en infecciones con varias especies microbianas, incluyendo Pseudomonas, Serratia, Clostridium, Cándida, Bacteroides, Porphyromonas y Staphylococcus sp. [4]. Muchas bacterias secretan varias proteasas inespecíficas, por ejemplo Pseudomonas, Serratia, Streptococcus, Staphylococcus y Bacteroides sp. tienen potentes proteasases metalo-, cisteína y serina con amplia gama de actividades [5]. El papel crítico de las proteasas bacterianas en la virulencia se demostró con éxito al eliminar el gen proteasaencoding en P. gingivalis [6]. La superfamilia de proteínas de cistatina recientemente descrita comprende inhibidores de la proteasa eucariótica y procariótica [7]. Cistatinas humanas C, D y S, cistatinas de rata A y S, cistatina de pollo y oriza cistatina inhiben la replicación de ciertos virus y bacterias [8] aunque todavía no se ha demostrado directamente que estos efectos se deban a la capacidad inhibitoria de proteasa de las cistatinas [9]. El papel clave de las proteasasasas de cisteína en infecciones microbianas, junto con la relativa falta de redundancia en comparación con los sistemas mamíferos, ha hecho que las proteasas microbianas sean objetivos atractivos para el desarrollo de Los sistemas de anillo de imidazopiridina representan una importante clase de compuestos no sólo por su interés teórico, sino también desde el punto de vista farmacológico. Se ha demostrado que poseen una amplia gama de actividades farmacológicas útiles [12] incluyendo antigástrico, antisecretario, anestésico local, antiviral, antiansiedad, antibacteriano, antifúngico, antihelmíntico, antiprotozoario, anticonvulsivo, gastrointestinal, antiulcer (Zolmidina), ansiolítico (Alpidem), hipnótico (Zolpidem) e inmunomodulador [13]. La naturaleza y la posición de los substituentes sobre la moiedad piridinica influyen en estas actividades farmacológicas. Estas estructuras heterocíclicas de imidazopiridina forman parte del esqueleto de alcaloides naturales, agentes bloqueantes neuromusculares [14], inhibidores reversibles de las enzimas H +, K + -ATPasa con una potente actividad antisecretaria, y se sabe que son hipnóticos sedantes del sistema nervioso [15]. En este estudio, hemos propuesto cinética y termodinámicamente caracterizar 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina como un potente y novedoso inhibidor de la proteasa cisteína que también actúa como agentes antibacterianos. La estructura cristalina de la papaína se extrajo del Protein Data Bank (código PDB: 1PE6) [16]. Se eliminaron todas las moléculas de agua y heteroatomos y se añadieron átomos de hidrógeno a la proteína. Se aplicó el campo de fuerza CharMm [17] y la estructura fue sometida a minimización de energía para 1000 pasos utilizando el método de descenso más empinado. Las estructuras químicas de todos los compuestos sintetizados fueron generadas utilizando quimdraw y posteriormente convertidas en formato 3D utilizando CORINA. Se realizó una serie de experimentos de acoplamiento con todas las energías de unión diseñadas de 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina contra papaína utilizando AutoDock Tools 4.0 [18] para posibles actividades inhibidoras de la cisteína-proteasa. Los compuestos fueron seleccionados sobre la base de sus energías de unión y aquellos que reflejan una buena afinidad de unión fueron analizados en la plataforma silica. Como parámetro para el acoplamiento molecular, se utilizó el algoritmo genético Lamarckian, una combinación entre el algoritmo genético y el algoritmo local de búsqueda Pseudo-Solis y Wets. Se generó una caja de cuadrícula de 60660660 Å alrededor del sitio activo de papaína, asegurándose de que estos inhibidores pueden girar libremente dentro de la cuadrícula. El número de carreras de acoplamiento se fijó en 10. Cada acoplamiento se repitió cinco veces, teniendo al final un total de 50 carreras de acoplamiento, para comprobar la precisión de los resultados. Los complejos finalmente obtenidos fueron visualizados posteriormente usando PyMol [19]. El trabajo fue autenticado posteriormente en el laboratorio húmedo después de su análisis detallado en la plataforma de silico. Los derivados diseñados fueron filtrados por la ''Regla de cinco'' de Lipinski que establece los criterios para propiedades similares a las drogas. La semejanza de drogas es una propiedad que se utiliza más a menudo para caracterizar compuestos de plomo novedosos [20]. De acuerdo con esta regla, se espera mala absorción si MW.500, log P.5, donantes de enlace de En las propiedades de absorción, distribución, metabolismo y excreción de silico (ADME) de estos derivados también se predijeron utilizando las siguientes herramientas bioinformáticas en línea. N http://www.organical-chemistry.org. N http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal. py? Form = admetox N https://secure.chemsilico.com/pages/submit.phpEl estudio anterior nos dio una idea sobre la existencia de posibles propiedades mutágenas y tumorígenas en compuestos sintetizados.El resultado obtenido nos ayudó a eliminar los compuestos sintetizados para su uso posterior como leads potentes. A partir de los resultados de los estudios de acoplamiento, se sintetizaron diez derivados de 1piridilimidazo[1,5-a]piridina según Siddiqui et al., 2006 [22] que se denominan así: 1- La capacidad de los derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina para inhibir las proteasasas de cisteína se probó utilizando papaína como enzima modelo. La actividad proteolítica de las mezclas de reacción se determinó utilizando Bz-DL-Arg-pNA como sustrato cromogénico [23]. A las soluciones de papaína activa (concentración final: 0,05 mM) se añadieron soluciones concentradas de los diferentes derivados a concentraciones finales de 0,2 mM. Después de la incubación durante 30 min a 37uC, se añadió la solución de sustrato y después de una incubación posterior durante 20 min, la reacción se interrumpió mediante la adición de ácido triclórico (TCA) al 5% acidificado con 2,25% de HCl y la absorción de la mezcla de reacción se determinó a una longitud de onda de 410 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad). El mismo procedimiento se utilizó a 32uC y 42uC para estudios termodinámicos. Los parámetros cinéticos para la hidrólisis del sustrato se determinaron mediante la medición de la tasa inicial de actividad enzimática. La constante de inhibición K i fue determinada por el método Dixon [24] y también por la ecuación Lineweaver-Burk. El valor de K m se calculó a partir de la ecuación de doble recíproco mediante la incorporación de los Para el análisis cinético y las determinaciones constantes de velocidad, los ensayos se realizaron por triplicado, y el valor promedio fue considerado a lo largo de este trabajo. Se utilizó la dependencia de temperatura de las constantes de inhibición para determinar los parámetros termodinámicos. Los cambios en la entalpía (DH) se determinaron a partir de las parcelas de Van't Hoff mediante el uso de la ecuación, donde DH es entalpía cambio, R es constante de gas, DS es entropía cambio y T es la temperatura absoluta. El cambio entropía se obtuvo a partir de la ecuación.El ensayo se realizó a diferentes temperaturas (32uC, 37uC, 42uC) calculando varios K i de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina derivados con papaína como enzima modelo.El método de difusión en disco [25] se utilizó para la evaluación antibacteriana preliminar de los derivados El MIC 50 de estos derivados, que mostró inhibición en las pruebas preliminares, fue determinado además por la técnica de placa de microtitro utilizando el método de microdilución [26]. En resumen, las cepas bacterianas (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii)) fueron cultivadas y diluidas hasta 2610 5 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml en tampón de fosfato sódico (SPB) que contenía 0,03% de caldo Luria-Bertani (LB). Los derivados sintetizados fueron disueltos en DMSO y su dilución en serie se realizó en 50 mL de medio LB en placa de microtitro de 96 pocillos para lograr las concentraciones requeridas (0,1-10 mg/ml) con inó El DMSO fue tomado como control negativo y Ceftriaxona y el clotrimazol fueron tomados como control positivo. Después de la incubación a 37uC durante la noche, los MIC fueron tomados como la concentración inhibidora más baja en la que se inhibió el crecimiento bacteriano. Se calculó el promedio de tres valores y fue el MIC para el material de prueba y cepa bacteriana. Para el método de recuento de placas de agar [27], 25 mL de alícuotas de bacterias a 1610 5 UFC/ml en SPB conteniendo 0,03% de caldo LB fueron incubados con 25 mL de compuestos diluidos durante 2 h a 37uC. Las mezclas de bacterias y compuestos se diluyeron en serie 10 veces con SPB y se plató en placas LB que fueron incubadas a 37uC de la noche a la mañana. Después de haber determinado los CMI, las cepas bacterianas de los pozos de la placa de microtitro sin crecimiento bacteriano visible fueron retiradas para subcultivo en serie de 2 ml en otra nueva placa de microtitro conteniendo 100 ml de caldo por pozo y posteriormente incubadas durante 24 h. La concentración más baja sin crecimiento visible fue definida como CMB [28], lo que indica la muerte del 99,5% del inóculo original. La absorción de cada pozo fue medida a una longitud de onda de 620 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad) y comparada con un vacío. Solvente (DMSO) fue utilizado como control negativo. Se realizaron tres réplicas para cada compuesto y el experimento se repitió dos veces. Las bacterias utilizan sus proteasas de cisteína para la patogeneidad como podría ser representado a partir de la estructura de homólogo Cif en Burkholderia pseudomallei (CHBP) que revela un pliegue tipo papaína y una tríada catalítica conservada Cys-His-Gln [29]. Se ha demostrado que los patógenos bacterianos tienen una actividad hidrolítica única como papaína para bloquear la progresión normal del ciclo celular huésped como el núcleo de una proteína de avirulencia (Avr) (AvrPphB) del patógeno vegetal Pseudomonas syringae, se asemeja a las proteasasasas de cisteína tipo papaína. La similitud de esta proteína AvrPphB con papaína incluye la tríada catalítica de Cys-98, His-212, y Asp-227 en el sitio Turk et al. han propuesto, sobre la base de estudios cinéticos y estructurales, que la papaína tiene siete subsitios en el sitio activo, pero sólo cinco subsitios son importantes que pueden unirse a un residuo de aminoácidos del sustrato [31]. Una variedad de intermedios se generan cuando la papaína reacciona con el sustrato o un inhibidor [2]. Al igual que las proteasasas de serina, las proteasasas de cisteína tienden a tener sitios activos relativamente poco profundos, expuestos a disolventes, que pueden acomodar segmentos cortos de sustrato/inhibidores de bucles proteicos (por ejemplo, a partir de inhibidores endógenos como las cistatinas) o hebras. Tipo de inhibición Ki (mM) IC 50 (mM) Compuesto no competitivo 13,7 13.4 unido a la proteasa con una combinación de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Como parte de nuestra investigación en el desarrollo de nuevos y eficientes inhibidores de la proteasa cisteína, diez derivados de la piridilimidazo [1,5a] piridina sustituida (3a-j) fueron diseñados y analizados principalmente sobre la base de sus energías de acoplamiento contra la papaína para dilucidar su posible modo de acción. Se encontró que estos compuestos eran inhibidores específicos de la proteasa cisteína, papaína y no mostraron inhibición contra otros tipos de proteasasasasas como la serina, aspártica o metalloproteasas. Son específicos para el clan CA de la proteasa cisteína y no mostraron ninguna inhibición significativa contra otros clanes de proteasasasasas Estos nuevos compuestos fueron concebidos sobre la base del conocimiento de la capacidad de una proteína para alterar su conformación para acomodar un ligando de unión y nos permitió comparar directamente las posiciones relativas del residuo en el bolsillo de unión. El estudio de acoplamiento molecular proporcionó la visión estructural sobre la unión de estos compuestos (3a-j) (Figura 1) dentro del sitio activo de papaína que consiste principalmente en una tríada catalítica de Cys 25, Sus 159 y Asp 175 [32]. Además, el papel de otros residuos presentes en el sitio activo de papaína, jugando un papel importante en el alojamiento de compuestos también se han revelado. Inicialmente, el acoplamiento se realizó con todos los compuestos diseñados (3a-j) contra papaína, una conocida enzima de proteasa cisteína y en este contexto, observamos resultados muy interesantes donde nuestros inhibidores propuestos (3a-j) aprovechan los residuos aromáticos e hidrofílicos haciendo una variedad de Aunque los compuestos 3e-j dieron resultados significativos cuando se acoplaron con papaína pero durante la evaluación de las propiedades antibacterianas en experimentos de laboratorio húmedos, dieron resultados insignificantes (datos no mostrados).Por lo tanto, sólo cuatro compuestos fueron considerados para discusión y otros experimentos como estudios cinéticos y termodinámicos para caracterizar a estos compuestos como potentes pro-inhibidores (3a-d). Los hallazgos del estudio anterior han demostrado que las interacciones moleculares entre los compuestos 3a-d y papaína fueron muy similares a las interacciones observadas para E-64c, un derivado del inhibidor epóxido natural (E-64c) (Figura 1 ) de proteasasasas de cisteína [31, 32], con papaína; especialmente con respecto a la unión de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas de los ligandos con residuos conservados en el sitio de unión catalítica ( Varios residuos de papaína participaron en interacciones hidrofóbicas con compuestos 3a-d, incluyendo Gln19, Cys25, Gly66 y Asp158. Las propiedades de piridina de compuestos 3a-d interactúan con el sitio S2 de papaína, que incluye (Tyr61, Asn64, Gly65 y Tyr67) aminoácidos (Figura 2 A-D). Los residuos activos del sitio que se encontró que son un agente clave en la interacción de compuestos dentro del sitio activo (principalmente a través de interacciones hidrofóbicas) fueron Cys25, Tyr61, His159 y Trp177, mientras que Trp177, Gln19 fueron encontrados para mí haciendo enlaces de hidrógeno sólo con el compuesto 3a. Además de estos muchos otros residuos también se encontraron involucrados activamente (Tabla 1). Además, las energías de unión para el compuesto 3a, 3b, 3c y 3d con papaína se encontraron en 26.12, 25.76, 26.84 y 25.62 Kcal/mol respectivamente, que estuvieron en gran acuerdo con nuestros experimentos de laboratorio húmedo; se discutirán más adelante (Tabla 1). Esto confirmó la exactitud de nuestro protocolo de acoplamiento. Puesto que, la energía de unión es una medida directa de la fuerza de interacción y nuestros compuestos 3a-d mostraron una unión más fuerte dentro del sitio activo de papaína en comparación con el inhibidor E-64c (DG: 24.04 Kcal/mol), por lo tanto, los resultados sugieren que estos derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina (3ad) podrían ser inhibidores potentes de papaína como proteasasas de cisteína. La interacción en silico de compuestos 3a-d con papaína, observada como se ha comentado anteriormente, fue validada con laboratorio húmedo Tabla 5. La predicción de compuestos antibacterianos como fármacos (http://www.organical-chemistry.org). Tabla 2). Curiosamente, las energías de unión observadas en silico para los compuestos 3a-d contra papaína se encontraron en gran concordancia (error estándar 62 Kcal/mol) con el valor de energía libre de unión (DG) observado durante los estudios termodinámicos ( Tabla 1 y 2). Del mismo modo, el cambio entalpía (DH) de la unión fue negativo mientras que el cambio entropía (DS) de la unión fue positivo que indicó la naturaleza exotérmica y entropica de la unión. Este patrón de dependencia de la temperatura es característico de la interacción hidrofóbica [33]. Como se discutió anteriormente que todos los compuestos (3a-d) fueron encontrados para interactuar con los residuos activos del sitio de papaína a través de interacciones hidrofóbicas en la mayoría de los casos durante los estudios de silico, lo mismo fue observado por el análisis de las parcelas de Van't Hoff para todos los inhibidores propuestos a tres temperaturas diferentes (32uC, 37uC y 42uC) en experimentos de laboratorio húmedo (Figura 3). Esto demuestra la importancia de estos tipos de interacciones en el posicionamiento de compuestos dentro del sitio activo. Por lo tanto, la termodinámica así como en el estudio de silico revela que las interacciones hidrofóbicas favorecen la unión de estos inhibidores propuestos con papaína como proteasasasas de cisteína. En resumen, los resultados anteriores de estudios de acoplamiento molecular y análisis termodinámico de compuestos 3a-d con papaína mostraron que estos compuestos tienen el potencial de ser inhibidores de la proteasa cisteína novedosos y únicos. En el estudio actual, la actividad inhibidora de la proteasa cisteína de derivados sintetizados de 1 piridilimidazo substituido[1,5-a] piridina (3a-d)] también se realizó contra la papaína y se observaron constantes de inhibición (K i ) para la citada enzima 13,70, 23,20, 90,00 y 99,30 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Además, los valores calculados de IC 50 fueron también de 13,40, 21,17, 94,50 y 96,50 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Excepto el compuesto 3b, el resto de los compuestos mostraron inhibiciones reversibles no competitivas, pero todos los compuestos, independientemente de los tipos de unión, mostraron interacción hidrofóbica y entrópicamente impulsada. Estos derivados (3a-j) fueron finalmente evaluados para sus actividades antibacterianas contra siete microbios clínicamente importantes (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii). Aquí, estamos mostrando los datos de sólo cuatro compuestos (3a-d) debido a sus resultados significativos (Tabla 4). Todos los compuestos siguieron estrictamente el patrón de actividad antiproteasa hacia el crecimiento bacteriano excepto P. vulgaris y E. coli en una instancia cada uno (Tabla 4). Dado que los compuestos 3c y 3d no tienen mucha diferencia en sus valores IC50 (3c-94.5 mM y 3d-96.5 mM) contra la proteasa de cisteína, papaína y por lo tanto en la actividad antibacteriana en todos los casos excepto uno. Puede ser aleatorio debido a tan cerca en valores IC50. Compuestos 3c y 3d están teniendo mucha diferencia en sus valores IC50 (3b-21.17 mM y 3c-94.5 mM) y mostraron patrón exacto para su actividad antibacteriana para todos los microbios excepto E. coli en un caso. Aunque E. coli contiene seis proteasasas de cisteína principales pero ninguno pertenece al clan CA de papaína. Se argumenta que estos compuestos también inhibieron las proteas de cisteína de otros clanes pero con baja eficacia. Dado que los derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina son un andamio absolutamente nuevo hacia los agentes antibacterianos y, por lo tanto, no se dispone de ningún compuesto estándar del mismo andamio. Así, Clotrimazol (1-[(2-clorofenil)(difenil)metil]-1H-imidazol), un derivado imidazol y Ceftriaxona (antibio de cefalosporina de tercera generación con actividad de amplio espectro frente a bacterias Gram positivas y Gramnegativas) se han utilizado como control positivo, mientras que DMSO se ha utilizado como control negativo. Se ha demostrado que todas las especies bacterianas mencionadas anteriormente secretan ciertas proteasasas de cisteína que desempeñan un papel muy importante en la patogeneidad de diferentes enfermedades causadas por estos microorganismos. Se observó que la concentración inhibitoria mínima (CMI) de compuestos (3a-d) (Tabla 4) frente a todas las bacterias probadas, excepto E. coli y P. vulgaris, estaba en gran acuerdo con sus respectivos valores constantes de inhibición (Ki)/IC 50 frente a la papaína (Tabla 3), lo que indica claramente que estos compuestos tienen el potencial de inhibir la papaína como las proteasasas de cisteína de estos patógenos. El coeficiente de partición (logP) es una medida bien establecida de la lipofilia del compuesto. La distribución de los valores de logP calculados (cLogP) de la mayoría de los fármacos en el mercado está en el rango de cero a cinco. Todos los compuestos estudiados excepto 3d, mostraron un buen acuerdo con los criterios establecidos para la predicción de un compuesto como fármaco potencial (Tabla 5). Todos los compuestos no muestran ninguna amenaza contra la evaluación del riesgo de toxicidad excepto el compuesto 3d que mostró una amenaza como efecto tumorógeno debido a la presencia de grupo de isobutilo. Entre todos los compuestos probados, el compuesto 3a fue el más potente cuyo MIC fue el más bajo de todos los compuestos probados y mostró una puntuación máxima de fármaco y valores positivos para la semejanza con el fármaco. En resumen, los resultados del presente estudio han establecido que los derivados piridilimidazo[1,5-a] de 1 sustituto podrían ser candidatos a inhibidores nuevos y potentes de papaína como las proteasasas de cisteína, que juegan un papel deletérgico en la progresión de diferentes enfermedades causadas por diversos microorganismos. Por lo tanto, este grupo de compuestos podría ser objeto de investigación futura para hacer frente a los desafíos con microorganismos resistentes que son una amenaza importante a nivel mundial.
|
¿ A qué temperatura se completó el ensayo?
| false
| 3,042
|
{
"text": [
"32uC, 37uC, 42uC"
],
"answer_start": [
9753
]
}
|
32uC, 37uC, 42uC
|
1,565
|
Diseño, síntesis, evaluación y termodinámica de un piridilimidazo substituido[1,5-a]Derivados de la piridina como inhibidores de la proteasa de la cisteínahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3734177/SHA: ee8483f8f2cc5fe38be4e5651eae3af9d0bb8220bAutores: Khan, Mohd Sajid; Baig, Mohd Hassan; Ahmad, Saheem; Siddiqui, Shapi Ahmad; Srivastava, Ashwini Kumar; Srinivasan, Kumar Venkatraman; Ansari, Irfan A. Fecha: 2013-08-05DOI: 10.1371/journal.pone.0069982Licencia: cc-byResumen: Las proteasas de cisteína de la familia de las papaínas son una de las nuevas estrategias en el desarrollo de quimioterapia para una serie de enfermedades. Los inhibidores de la proteasa de cisteína nuevos derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina que representan la clase farmacológicamente importante de compuestos se reportan aquí por primera vez. Los derivados fueron inicialmente diseñados y analizados en silico mediante estudios moleculares de acoplamiento contra la papaína para explorar el posible modo de acción. La interacción molecular entre los compuestos y la proteasa de cisteína (papain) se encontró muy similar a las interacciones observadas con el respectivo inhibidor epóxido (E-64c) de la papaína. Posteriormente, los compuestos fueron sintetizados para validar su Cuando se caracterizan cinéticamente, estos compuestos muestran sus valores de K(i) y IC(50) en el rango de 13,75 a 99,30 μM y 13,40 a 96,50 μM, respectivamente. Los estudios termodinámicos sugieren su unión con la papaína impulsada hidrofóbica y entrópicamente. Estos inhibidores también inhiben el crecimiento de diferentes tipos clínicamente importantes de bacterias Gram positivas y Gram negativas con valores MIC(50) en el rango de 0,6–1,4 μg/ml. Basados en la regla de Lipinski de Cinco, también proponemos estos compuestos como potentes profármacos antibacterianos. El compuesto antibacteriano más activo fue 1-(2-piridil)-3-(2-hidroxifenil)imidazo[1,5-a]piridina (3a). Texto: Los inhibidores de la proteasa cisteína (IPC) han ganado considerable atención en las últimas dos décadas y muchas clases de compuestos están actualmente en ensayos clínicos humanos para una serie de enfermedades. El interés en las proteasasas de la familia de la papaína como objetivos quimioterapéuticos se deriva del reconocimiento de que son críticos para el ciclo de vida o patogenicidad de muchos microorganismos. Las proteasas de la cisteína de Streptococcus sp. (streptopain) [1], Staphylococcus sp. (staphopain) [2], Plasmodium falciparum (falcipain-1, -2, y -3) y Trypanosoma cruzi (cruzipain) [3] son algunos de los miembros más estudiados de la familia de la papaína que se ha informado que están relacionados con la gravedad de la infección y diversas condiciones patológicas causadas La activación de la vía kallikreina-kinina, que podría ser activada por más de dieciséis proteasas bacterianas, es un mecanismo que algunos patógenos explotan para asegurar que hay un suministro de nutrientes al lugar de la infección por el aumento de la permeabilidad vascular. Esto se ha demostrado que ocurre en infecciones con varias especies microbianas, incluyendo Pseudomonas, Serratia, Clostridium, Cándida, Bacteroides, Porphyromonas y Staphylococcus sp. [4]. Muchas bacterias secretan varias proteasas inespecíficas, por ejemplo Pseudomonas, Serratia, Streptococcus, Staphylococcus y Bacteroides sp. tienen potentes proteasases metalo-, cisteína y serina con amplia gama de actividades [5]. El papel crítico de las proteasas bacterianas en la virulencia se demostró con éxito al eliminar el gen proteasaencoding en P. gingivalis [6]. La superfamilia de proteínas de cistatina recientemente descrita comprende inhibidores de la proteasa eucariótica y procariótica [7]. Cistatinas humanas C, D y S, cistatinas de rata A y S, cistatina de pollo y oriza cistatina inhiben la replicación de ciertos virus y bacterias [8] aunque todavía no se ha demostrado directamente que estos efectos se deban a la capacidad inhibitoria de proteasa de las cistatinas [9]. El papel clave de las proteasasasas de cisteína en infecciones microbianas, junto con la relativa falta de redundancia en comparación con los sistemas mamíferos, ha hecho que las proteasas microbianas sean objetivos atractivos para el desarrollo de Los sistemas de anillo de imidazopiridina representan una importante clase de compuestos no sólo por su interés teórico, sino también desde el punto de vista farmacológico. Se ha demostrado que poseen una amplia gama de actividades farmacológicas útiles [12] incluyendo antigástrico, antisecretario, anestésico local, antiviral, antiansiedad, antibacteriano, antifúngico, antihelmíntico, antiprotozoario, anticonvulsivo, gastrointestinal, antiulcer (Zolmidina), ansiolítico (Alpidem), hipnótico (Zolpidem) e inmunomodulador [13]. La naturaleza y la posición de los substituentes sobre la moiedad piridinica influyen en estas actividades farmacológicas. Estas estructuras heterocíclicas de imidazopiridina forman parte del esqueleto de alcaloides naturales, agentes bloqueantes neuromusculares [14], inhibidores reversibles de las enzimas H +, K + -ATPasa con una potente actividad antisecretaria, y se sabe que son hipnóticos sedantes del sistema nervioso [15]. En este estudio, hemos propuesto cinética y termodinámicamente caracterizar 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina como un potente y novedoso inhibidor de la proteasa cisteína que también actúa como agentes antibacterianos. La estructura cristalina de la papaína se extrajo del Protein Data Bank (código PDB: 1PE6) [16]. Se eliminaron todas las moléculas de agua y heteroatomos y se añadieron átomos de hidrógeno a la proteína. Se aplicó el campo de fuerza CharMm [17] y la estructura fue sometida a minimización de energía para 1000 pasos utilizando el método de descenso más empinado. Las estructuras químicas de todos los compuestos sintetizados fueron generadas utilizando quimdraw y posteriormente convertidas en formato 3D utilizando CORINA. Se realizó una serie de experimentos de acoplamiento con todas las energías de unión diseñadas de 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina contra papaína utilizando AutoDock Tools 4.0 [18] para posibles actividades inhibidoras de la cisteína-proteasa. Los compuestos fueron seleccionados sobre la base de sus energías de unión y aquellos que reflejan una buena afinidad de unión fueron analizados en la plataforma silica. Como parámetro para el acoplamiento molecular, se utilizó el algoritmo genético Lamarckian, una combinación entre el algoritmo genético y el algoritmo local de búsqueda Pseudo-Solis y Wets. Se generó una caja de cuadrícula de 60660660 Å alrededor del sitio activo de papaína, asegurándose de que estos inhibidores pueden girar libremente dentro de la cuadrícula. El número de carreras de acoplamiento se fijó en 10. Cada acoplamiento se repitió cinco veces, teniendo al final un total de 50 carreras de acoplamiento, para comprobar la precisión de los resultados. Los complejos finalmente obtenidos fueron visualizados posteriormente usando PyMol [19]. El trabajo fue autenticado posteriormente en el laboratorio húmedo después de su análisis detallado en la plataforma de silico. Los derivados diseñados fueron filtrados por la ''Regla de cinco'' de Lipinski que establece los criterios para propiedades similares a las drogas. La semejanza de drogas es una propiedad que se utiliza más a menudo para caracterizar compuestos de plomo novedosos [20]. De acuerdo con esta regla, se espera mala absorción si MW.500, log P.5, donantes de enlace de En las propiedades de absorción, distribución, metabolismo y excreción de silico (ADME) de estos derivados también se predijeron utilizando las siguientes herramientas bioinformáticas en línea. N http://www.organical-chemistry.org. N http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal. py? Form = admetox N https://secure.chemsilico.com/pages/submit.phpEl estudio anterior nos dio una idea sobre la existencia de posibles propiedades mutágenas y tumorígenas en compuestos sintetizados.El resultado obtenido nos ayudó a eliminar los compuestos sintetizados para su uso posterior como leads potentes. A partir de los resultados de los estudios de acoplamiento, se sintetizaron diez derivados de 1piridilimidazo[1,5-a]piridina según Siddiqui et al., 2006 [22] que se denominan así: 1- La capacidad de los derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina para inhibir las proteasasas de cisteína se probó utilizando papaína como enzima modelo. La actividad proteolítica de las mezclas de reacción se determinó utilizando Bz-DL-Arg-pNA como sustrato cromogénico [23]. A las soluciones de papaína activa (concentración final: 0,05 mM) se añadieron soluciones concentradas de los diferentes derivados a concentraciones finales de 0,2 mM. Después de la incubación durante 30 min a 37uC, se añadió la solución de sustrato y después de una incubación posterior durante 20 min, la reacción se interrumpió mediante la adición de ácido triclórico (TCA) al 5% acidificado con 2,25% de HCl y la absorción de la mezcla de reacción se determinó a una longitud de onda de 410 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad). El mismo procedimiento se utilizó a 32uC y 42uC para estudios termodinámicos. Los parámetros cinéticos para la hidrólisis del sustrato se determinaron mediante la medición de la tasa inicial de actividad enzimática. La constante de inhibición K i fue determinada por el método Dixon [24] y también por la ecuación Lineweaver-Burk. El valor de K m se calculó a partir de la ecuación de doble recíproco mediante la incorporación de los Para el análisis cinético y las determinaciones constantes de velocidad, los ensayos se realizaron por triplicado, y el valor promedio fue considerado a lo largo de este trabajo. Se utilizó la dependencia de temperatura de las constantes de inhibición para determinar los parámetros termodinámicos. Los cambios en la entalpía (DH) se determinaron a partir de las parcelas de Van't Hoff mediante el uso de la ecuación, donde DH es entalpía cambio, R es constante de gas, DS es entropía cambio y T es la temperatura absoluta. El cambio entropía se obtuvo a partir de la ecuación.El ensayo se realizó a diferentes temperaturas (32uC, 37uC, 42uC) calculando varios K i de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina derivados con papaína como enzima modelo.El método de difusión en disco [25] se utilizó para la evaluación antibacteriana preliminar de los derivados El MIC 50 de estos derivados, que mostró inhibición en las pruebas preliminares, fue determinado además por la técnica de placa de microtitro utilizando el método de microdilución [26]. En resumen, las cepas bacterianas (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii)) fueron cultivadas y diluidas hasta 2610 5 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml en tampón de fosfato sódico (SPB) que contenía 0,03% de caldo Luria-Bertani (LB). Los derivados sintetizados fueron disueltos en DMSO y su dilución en serie se realizó en 50 mL de medio LB en placa de microtitro de 96 pocillos para lograr las concentraciones requeridas (0,1-10 mg/ml) con inó El DMSO fue tomado como control negativo y Ceftriaxona y el clotrimazol fueron tomados como control positivo. Después de la incubación a 37uC durante la noche, los MIC fueron tomados como la concentración inhibidora más baja en la que se inhibió el crecimiento bacteriano. Se calculó el promedio de tres valores y fue el MIC para el material de prueba y cepa bacteriana. Para el método de recuento de placas de agar [27], 25 mL de alícuotas de bacterias a 1610 5 UFC/ml en SPB conteniendo 0,03% de caldo LB fueron incubados con 25 mL de compuestos diluidos durante 2 h a 37uC. Las mezclas de bacterias y compuestos se diluyeron en serie 10 veces con SPB y se plató en placas LB que fueron incubadas a 37uC de la noche a la mañana. Después de haber determinado los CMI, las cepas bacterianas de los pozos de la placa de microtitro sin crecimiento bacteriano visible fueron retiradas para subcultivo en serie de 2 ml en otra nueva placa de microtitro conteniendo 100 ml de caldo por pozo y posteriormente incubadas durante 24 h. La concentración más baja sin crecimiento visible fue definida como CMB [28], lo que indica la muerte del 99,5% del inóculo original. La absorción de cada pozo fue medida a una longitud de onda de 620 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad) y comparada con un vacío. Solvente (DMSO) fue utilizado como control negativo. Se realizaron tres réplicas para cada compuesto y el experimento se repitió dos veces. Las bacterias utilizan sus proteasas de cisteína para la patogeneidad como podría ser representado a partir de la estructura de homólogo Cif en Burkholderia pseudomallei (CHBP) que revela un pliegue tipo papaína y una tríada catalítica conservada Cys-His-Gln [29]. Se ha demostrado que los patógenos bacterianos tienen una actividad hidrolítica única como papaína para bloquear la progresión normal del ciclo celular huésped como el núcleo de una proteína de avirulencia (Avr) (AvrPphB) del patógeno vegetal Pseudomonas syringae, se asemeja a las proteasasasas de cisteína tipo papaína. La similitud de esta proteína AvrPphB con papaína incluye la tríada catalítica de Cys-98, His-212, y Asp-227 en el sitio Turk et al. han propuesto, sobre la base de estudios cinéticos y estructurales, que la papaína tiene siete subsitios en el sitio activo, pero sólo cinco subsitios son importantes que pueden unirse a un residuo de aminoácidos del sustrato [31]. Una variedad de intermedios se generan cuando la papaína reacciona con el sustrato o un inhibidor [2]. Al igual que las proteasasas de serina, las proteasasas de cisteína tienden a tener sitios activos relativamente poco profundos, expuestos a disolventes, que pueden acomodar segmentos cortos de sustrato/inhibidores de bucles proteicos (por ejemplo, a partir de inhibidores endógenos como las cistatinas) o hebras. Tipo de inhibición Ki (mM) IC 50 (mM) Compuesto no competitivo 13,7 13.4 unido a la proteasa con una combinación de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Como parte de nuestra investigación en el desarrollo de nuevos y eficientes inhibidores de la proteasa cisteína, diez derivados de la piridilimidazo [1,5a] piridina sustituida (3a-j) fueron diseñados y analizados principalmente sobre la base de sus energías de acoplamiento contra la papaína para dilucidar su posible modo de acción. Se encontró que estos compuestos eran inhibidores específicos de la proteasa cisteína, papaína y no mostraron inhibición contra otros tipos de proteasasasasas como la serina, aspártica o metalloproteasas. Son específicos para el clan CA de la proteasa cisteína y no mostraron ninguna inhibición significativa contra otros clanes de proteasasasasas Estos nuevos compuestos fueron concebidos sobre la base del conocimiento de la capacidad de una proteína para alterar su conformación para acomodar un ligando de unión y nos permitió comparar directamente las posiciones relativas del residuo en el bolsillo de unión. El estudio de acoplamiento molecular proporcionó la visión estructural sobre la unión de estos compuestos (3a-j) (Figura 1) dentro del sitio activo de papaína que consiste principalmente en una tríada catalítica de Cys 25, Sus 159 y Asp 175 [32]. Además, el papel de otros residuos presentes en el sitio activo de papaína, jugando un papel importante en el alojamiento de compuestos también se han revelado. Inicialmente, el acoplamiento se realizó con todos los compuestos diseñados (3a-j) contra papaína, una conocida enzima de proteasa cisteína y en este contexto, observamos resultados muy interesantes donde nuestros inhibidores propuestos (3a-j) aprovechan los residuos aromáticos e hidrofílicos haciendo una variedad de Aunque los compuestos 3e-j dieron resultados significativos cuando se acoplaron con papaína pero durante la evaluación de las propiedades antibacterianas en experimentos de laboratorio húmedos, dieron resultados insignificantes (datos no mostrados).Por lo tanto, sólo cuatro compuestos fueron considerados para discusión y otros experimentos como estudios cinéticos y termodinámicos para caracterizar a estos compuestos como potentes pro-inhibidores (3a-d). Los hallazgos del estudio anterior han demostrado que las interacciones moleculares entre los compuestos 3a-d y papaína fueron muy similares a las interacciones observadas para E-64c, un derivado del inhibidor epóxido natural (E-64c) (Figura 1 ) de proteasasasas de cisteína [31, 32], con papaína; especialmente con respecto a la unión de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas de los ligandos con residuos conservados en el sitio de unión catalítica ( Varios residuos de papaína participaron en interacciones hidrofóbicas con compuestos 3a-d, incluyendo Gln19, Cys25, Gly66 y Asp158. Las propiedades de piridina de compuestos 3a-d interactúan con el sitio S2 de papaína, que incluye (Tyr61, Asn64, Gly65 y Tyr67) aminoácidos (Figura 2 A-D). Los residuos activos del sitio que se encontró que son un agente clave en la interacción de compuestos dentro del sitio activo (principalmente a través de interacciones hidrofóbicas) fueron Cys25, Tyr61, His159 y Trp177, mientras que Trp177, Gln19 fueron encontrados para mí haciendo enlaces de hidrógeno sólo con el compuesto 3a. Además de estos muchos otros residuos también se encontraron involucrados activamente (Tabla 1). Además, las energías de unión para el compuesto 3a, 3b, 3c y 3d con papaína se encontraron en 26.12, 25.76, 26.84 y 25.62 Kcal/mol respectivamente, que estuvieron en gran acuerdo con nuestros experimentos de laboratorio húmedo; se discutirán más adelante (Tabla 1). Esto confirmó la exactitud de nuestro protocolo de acoplamiento. Puesto que, la energía de unión es una medida directa de la fuerza de interacción y nuestros compuestos 3a-d mostraron una unión más fuerte dentro del sitio activo de papaína en comparación con el inhibidor E-64c (DG: 24.04 Kcal/mol), por lo tanto, los resultados sugieren que estos derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina (3ad) podrían ser inhibidores potentes de papaína como proteasasas de cisteína. La interacción en silico de compuestos 3a-d con papaína, observada como se ha comentado anteriormente, fue validada con laboratorio húmedo Tabla 5. La predicción de compuestos antibacterianos como fármacos (http://www.organical-chemistry.org). Tabla 2). Curiosamente, las energías de unión observadas en silico para los compuestos 3a-d contra papaína se encontraron en gran concordancia (error estándar 62 Kcal/mol) con el valor de energía libre de unión (DG) observado durante los estudios termodinámicos ( Tabla 1 y 2). Del mismo modo, el cambio entalpía (DH) de la unión fue negativo mientras que el cambio entropía (DS) de la unión fue positivo que indicó la naturaleza exotérmica y entropica de la unión. Este patrón de dependencia de la temperatura es característico de la interacción hidrofóbica [33]. Como se discutió anteriormente que todos los compuestos (3a-d) fueron encontrados para interactuar con los residuos activos del sitio de papaína a través de interacciones hidrofóbicas en la mayoría de los casos durante los estudios de silico, lo mismo fue observado por el análisis de las parcelas de Van't Hoff para todos los inhibidores propuestos a tres temperaturas diferentes (32uC, 37uC y 42uC) en experimentos de laboratorio húmedo (Figura 3). Esto demuestra la importancia de estos tipos de interacciones en el posicionamiento de compuestos dentro del sitio activo. Por lo tanto, la termodinámica así como en el estudio de silico revela que las interacciones hidrofóbicas favorecen la unión de estos inhibidores propuestos con papaína como proteasasasas de cisteína. En resumen, los resultados anteriores de estudios de acoplamiento molecular y análisis termodinámico de compuestos 3a-d con papaína mostraron que estos compuestos tienen el potencial de ser inhibidores de la proteasa cisteína novedosos y únicos. En el estudio actual, la actividad inhibidora de la proteasa cisteína de derivados sintetizados de 1 piridilimidazo substituido[1,5-a] piridina (3a-d)] también se realizó contra la papaína y se observaron constantes de inhibición (K i ) para la citada enzima 13,70, 23,20, 90,00 y 99,30 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Además, los valores calculados de IC 50 fueron también de 13,40, 21,17, 94,50 y 96,50 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Excepto el compuesto 3b, el resto de los compuestos mostraron inhibiciones reversibles no competitivas, pero todos los compuestos, independientemente de los tipos de unión, mostraron interacción hidrofóbica y entrópicamente impulsada. Estos derivados (3a-j) fueron finalmente evaluados para sus actividades antibacterianas contra siete microbios clínicamente importantes (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii). Aquí, estamos mostrando los datos de sólo cuatro compuestos (3a-d) debido a sus resultados significativos (Tabla 4). Todos los compuestos siguieron estrictamente el patrón de actividad antiproteasa hacia el crecimiento bacteriano excepto P. vulgaris y E. coli en una instancia cada uno (Tabla 4). Dado que los compuestos 3c y 3d no tienen mucha diferencia en sus valores IC50 (3c-94.5 mM y 3d-96.5 mM) contra la proteasa de cisteína, papaína y por lo tanto en la actividad antibacteriana en todos los casos excepto uno. Puede ser aleatorio debido a tan cerca en valores IC50. Compuestos 3c y 3d están teniendo mucha diferencia en sus valores IC50 (3b-21.17 mM y 3c-94.5 mM) y mostraron patrón exacto para su actividad antibacteriana para todos los microbios excepto E. coli en un caso. Aunque E. coli contiene seis proteasasas de cisteína principales pero ninguno pertenece al clan CA de papaína. Se argumenta que estos compuestos también inhibieron las proteas de cisteína de otros clanes pero con baja eficacia. Dado que los derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina son un andamio absolutamente nuevo hacia los agentes antibacterianos y, por lo tanto, no se dispone de ningún compuesto estándar del mismo andamio. Así, Clotrimazol (1-[(2-clorofenil)(difenil)metil]-1H-imidazol), un derivado imidazol y Ceftriaxona (antibio de cefalosporina de tercera generación con actividad de amplio espectro frente a bacterias Gram positivas y Gramnegativas) se han utilizado como control positivo, mientras que DMSO se ha utilizado como control negativo. Se ha demostrado que todas las especies bacterianas mencionadas anteriormente secretan ciertas proteasasas de cisteína que desempeñan un papel muy importante en la patogeneidad de diferentes enfermedades causadas por estos microorganismos. Se observó que la concentración inhibitoria mínima (CMI) de compuestos (3a-d) (Tabla 4) frente a todas las bacterias probadas, excepto E. coli y P. vulgaris, estaba en gran acuerdo con sus respectivos valores constantes de inhibición (Ki)/IC 50 frente a la papaína (Tabla 3), lo que indica claramente que estos compuestos tienen el potencial de inhibir la papaína como las proteasasas de cisteína de estos patógenos. El coeficiente de partición (logP) es una medida bien establecida de la lipofilia del compuesto. La distribución de los valores de logP calculados (cLogP) de la mayoría de los fármacos en el mercado está en el rango de cero a cinco. Todos los compuestos estudiados excepto 3d, mostraron un buen acuerdo con los criterios establecidos para la predicción de un compuesto como fármaco potencial (Tabla 5). Todos los compuestos no muestran ninguna amenaza contra la evaluación del riesgo de toxicidad excepto el compuesto 3d que mostró una amenaza como efecto tumorógeno debido a la presencia de grupo de isobutilo. Entre todos los compuestos probados, el compuesto 3a fue el más potente cuyo MIC fue el más bajo de todos los compuestos probados y mostró una puntuación máxima de fármaco y valores positivos para la semejanza con el fármaco. En resumen, los resultados del presente estudio han establecido que los derivados piridilimidazo[1,5-a] de 1 sustituto podrían ser candidatos a inhibidores nuevos y potentes de papaína como las proteasasas de cisteína, que juegan un papel deletérgico en la progresión de diferentes enfermedades causadas por diversos microorganismos. Por lo tanto, este grupo de compuestos podría ser objeto de investigación futura para hacer frente a los desafíos con microorganismos resistentes que son una amenaza importante a nivel mundial.
|
¿Qué criterios establecen las pautas para las propiedades similares a las drogas?
| false
| 3,043
|
{
"text": [
"Lipinski's ''Rule of five''"
],
"answer_start": [
6881
]
}
|
La ''Regla de los Cinco'' de Lipinski
|
1,565
|
Diseño, síntesis, evaluación y termodinámica de un piridilimidazo substituido[1,5-a]Derivados de la piridina como inhibidores de la proteasa de la cisteínahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3734177/SHA: ee8483f8f2cc5fe38be4e5651eae3af9d0bb8220bAutores: Khan, Mohd Sajid; Baig, Mohd Hassan; Ahmad, Saheem; Siddiqui, Shapi Ahmad; Srivastava, Ashwini Kumar; Srinivasan, Kumar Venkatraman; Ansari, Irfan A. Fecha: 2013-08-05DOI: 10.1371/journal.pone.0069982Licencia: cc-byResumen: Las proteasas de cisteína de la familia de las papaínas son una de las nuevas estrategias en el desarrollo de quimioterapia para una serie de enfermedades. Los inhibidores de la proteasa de cisteína nuevos derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina que representan la clase farmacológicamente importante de compuestos se reportan aquí por primera vez. Los derivados fueron inicialmente diseñados y analizados en silico mediante estudios moleculares de acoplamiento contra la papaína para explorar el posible modo de acción. La interacción molecular entre los compuestos y la proteasa de cisteína (papain) se encontró muy similar a las interacciones observadas con el respectivo inhibidor epóxido (E-64c) de la papaína. Posteriormente, los compuestos fueron sintetizados para validar su Cuando se caracterizan cinéticamente, estos compuestos muestran sus valores de K(i) y IC(50) en el rango de 13,75 a 99,30 μM y 13,40 a 96,50 μM, respectivamente. Los estudios termodinámicos sugieren su unión con la papaína impulsada hidrofóbica y entrópicamente. Estos inhibidores también inhiben el crecimiento de diferentes tipos clínicamente importantes de bacterias Gram positivas y Gram negativas con valores MIC(50) en el rango de 0,6–1,4 μg/ml. Basados en la regla de Lipinski de Cinco, también proponemos estos compuestos como potentes profármacos antibacterianos. El compuesto antibacteriano más activo fue 1-(2-piridil)-3-(2-hidroxifenil)imidazo[1,5-a]piridina (3a). Texto: Los inhibidores de la proteasa cisteína (IPC) han ganado considerable atención en las últimas dos décadas y muchas clases de compuestos están actualmente en ensayos clínicos humanos para una serie de enfermedades. El interés en las proteasasas de la familia de la papaína como objetivos quimioterapéuticos se deriva del reconocimiento de que son críticos para el ciclo de vida o patogenicidad de muchos microorganismos. Las proteasas de la cisteína de Streptococcus sp. (streptopain) [1], Staphylococcus sp. (staphopain) [2], Plasmodium falciparum (falcipain-1, -2, y -3) y Trypanosoma cruzi (cruzipain) [3] son algunos de los miembros más estudiados de la familia de la papaína que se ha informado que están relacionados con la gravedad de la infección y diversas condiciones patológicas causadas La activación de la vía kallikreina-kinina, que podría ser activada por más de dieciséis proteasas bacterianas, es un mecanismo que algunos patógenos explotan para asegurar que hay un suministro de nutrientes al lugar de la infección por el aumento de la permeabilidad vascular. Esto se ha demostrado que ocurre en infecciones con varias especies microbianas, incluyendo Pseudomonas, Serratia, Clostridium, Cándida, Bacteroides, Porphyromonas y Staphylococcus sp. [4]. Muchas bacterias secretan varias proteasas inespecíficas, por ejemplo Pseudomonas, Serratia, Streptococcus, Staphylococcus y Bacteroides sp. tienen potentes proteasases metalo-, cisteína y serina con amplia gama de actividades [5]. El papel crítico de las proteasas bacterianas en la virulencia se demostró con éxito al eliminar el gen proteasaencoding en P. gingivalis [6]. La superfamilia de proteínas de cistatina recientemente descrita comprende inhibidores de la proteasa eucariótica y procariótica [7]. Cistatinas humanas C, D y S, cistatinas de rata A y S, cistatina de pollo y oriza cistatina inhiben la replicación de ciertos virus y bacterias [8] aunque todavía no se ha demostrado directamente que estos efectos se deban a la capacidad inhibitoria de proteasa de las cistatinas [9]. El papel clave de las proteasasasas de cisteína en infecciones microbianas, junto con la relativa falta de redundancia en comparación con los sistemas mamíferos, ha hecho que las proteasas microbianas sean objetivos atractivos para el desarrollo de Los sistemas de anillo de imidazopiridina representan una importante clase de compuestos no sólo por su interés teórico, sino también desde el punto de vista farmacológico. Se ha demostrado que poseen una amplia gama de actividades farmacológicas útiles [12] incluyendo antigástrico, antisecretario, anestésico local, antiviral, antiansiedad, antibacteriano, antifúngico, antihelmíntico, antiprotozoario, anticonvulsivo, gastrointestinal, antiulcer (Zolmidina), ansiolítico (Alpidem), hipnótico (Zolpidem) e inmunomodulador [13]. La naturaleza y la posición de los substituentes sobre la moiedad piridinica influyen en estas actividades farmacológicas. Estas estructuras heterocíclicas de imidazopiridina forman parte del esqueleto de alcaloides naturales, agentes bloqueantes neuromusculares [14], inhibidores reversibles de las enzimas H +, K + -ATPasa con una potente actividad antisecretaria, y se sabe que son hipnóticos sedantes del sistema nervioso [15]. En este estudio, hemos propuesto cinética y termodinámicamente caracterizar 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina como un potente y novedoso inhibidor de la proteasa cisteína que también actúa como agentes antibacterianos. La estructura cristalina de la papaína se extrajo del Protein Data Bank (código PDB: 1PE6) [16]. Se eliminaron todas las moléculas de agua y heteroatomos y se añadieron átomos de hidrógeno a la proteína. Se aplicó el campo de fuerza CharMm [17] y la estructura fue sometida a minimización de energía para 1000 pasos utilizando el método de descenso más empinado. Las estructuras químicas de todos los compuestos sintetizados fueron generadas utilizando quimdraw y posteriormente convertidas en formato 3D utilizando CORINA. Se realizó una serie de experimentos de acoplamiento con todas las energías de unión diseñadas de 1 piridilimidazo[1,5-a] derivados de la piridina contra papaína utilizando AutoDock Tools 4.0 [18] para posibles actividades inhibidoras de la cisteína-proteasa. Los compuestos fueron seleccionados sobre la base de sus energías de unión y aquellos que reflejan una buena afinidad de unión fueron analizados en la plataforma silica. Como parámetro para el acoplamiento molecular, se utilizó el algoritmo genético Lamarckian, una combinación entre el algoritmo genético y el algoritmo local de búsqueda Pseudo-Solis y Wets. Se generó una caja de cuadrícula de 60660660 Å alrededor del sitio activo de papaína, asegurándose de que estos inhibidores pueden girar libremente dentro de la cuadrícula. El número de carreras de acoplamiento se fijó en 10. Cada acoplamiento se repitió cinco veces, teniendo al final un total de 50 carreras de acoplamiento, para comprobar la precisión de los resultados. Los complejos finalmente obtenidos fueron visualizados posteriormente usando PyMol [19]. El trabajo fue autenticado posteriormente en el laboratorio húmedo después de su análisis detallado en la plataforma de silico. Los derivados diseñados fueron filtrados por la ''Regla de cinco'' de Lipinski que establece los criterios para propiedades similares a las drogas. La semejanza de drogas es una propiedad que se utiliza más a menudo para caracterizar compuestos de plomo novedosos [20]. De acuerdo con esta regla, se espera mala absorción si MW.500, log P.5, donantes de enlace de En las propiedades de absorción, distribución, metabolismo y excreción de silico (ADME) de estos derivados también se predijeron utilizando las siguientes herramientas bioinformáticas en línea. N http://www.organical-chemistry.org. N http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal. py? Form = admetox N https://secure.chemsilico.com/pages/submit.phpEl estudio anterior nos dio una idea sobre la existencia de posibles propiedades mutágenas y tumorígenas en compuestos sintetizados.El resultado obtenido nos ayudó a eliminar los compuestos sintetizados para su uso posterior como leads potentes. A partir de los resultados de los estudios de acoplamiento, se sintetizaron diez derivados de 1piridilimidazo[1,5-a]piridina según Siddiqui et al., 2006 [22] que se denominan así: 1- La capacidad de los derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina para inhibir las proteasasas de cisteína se probó utilizando papaína como enzima modelo. La actividad proteolítica de las mezclas de reacción se determinó utilizando Bz-DL-Arg-pNA como sustrato cromogénico [23]. A las soluciones de papaína activa (concentración final: 0,05 mM) se añadieron soluciones concentradas de los diferentes derivados a concentraciones finales de 0,2 mM. Después de la incubación durante 30 min a 37uC, se añadió la solución de sustrato y después de una incubación posterior durante 20 min, la reacción se interrumpió mediante la adición de ácido triclórico (TCA) al 5% acidificado con 2,25% de HCl y la absorción de la mezcla de reacción se determinó a una longitud de onda de 410 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad). El mismo procedimiento se utilizó a 32uC y 42uC para estudios termodinámicos. Los parámetros cinéticos para la hidrólisis del sustrato se determinaron mediante la medición de la tasa inicial de actividad enzimática. La constante de inhibición K i fue determinada por el método Dixon [24] y también por la ecuación Lineweaver-Burk. El valor de K m se calculó a partir de la ecuación de doble recíproco mediante la incorporación de los Para el análisis cinético y las determinaciones constantes de velocidad, los ensayos se realizaron por triplicado, y el valor promedio fue considerado a lo largo de este trabajo. Se utilizó la dependencia de temperatura de las constantes de inhibición para determinar los parámetros termodinámicos. Los cambios en la entalpía (DH) se determinaron a partir de las parcelas de Van't Hoff mediante el uso de la ecuación, donde DH es entalpía cambio, R es constante de gas, DS es entropía cambio y T es la temperatura absoluta. El cambio entropía se obtuvo a partir de la ecuación.El ensayo se realizó a diferentes temperaturas (32uC, 37uC, 42uC) calculando varios K i de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina derivados con papaína como enzima modelo.El método de difusión en disco [25] se utilizó para la evaluación antibacteriana preliminar de los derivados El MIC 50 de estos derivados, que mostró inhibición en las pruebas preliminares, fue determinado además por la técnica de placa de microtitro utilizando el método de microdilución [26]. En resumen, las cepas bacterianas (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii)) fueron cultivadas y diluidas hasta 2610 5 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml en tampón de fosfato sódico (SPB) que contenía 0,03% de caldo Luria-Bertani (LB). Los derivados sintetizados fueron disueltos en DMSO y su dilución en serie se realizó en 50 mL de medio LB en placa de microtitro de 96 pocillos para lograr las concentraciones requeridas (0,1-10 mg/ml) con inó El DMSO fue tomado como control negativo y Ceftriaxona y el clotrimazol fueron tomados como control positivo. Después de la incubación a 37uC durante la noche, los MIC fueron tomados como la concentración inhibidora más baja en la que se inhibió el crecimiento bacteriano. Se calculó el promedio de tres valores y fue el MIC para el material de prueba y cepa bacteriana. Para el método de recuento de placas de agar [27], 25 mL de alícuotas de bacterias a 1610 5 UFC/ml en SPB conteniendo 0,03% de caldo LB fueron incubados con 25 mL de compuestos diluidos durante 2 h a 37uC. Las mezclas de bacterias y compuestos se diluyeron en serie 10 veces con SPB y se plató en placas LB que fueron incubadas a 37uC de la noche a la mañana. Después de haber determinado los CMI, las cepas bacterianas de los pozos de la placa de microtitro sin crecimiento bacteriano visible fueron retiradas para subcultivo en serie de 2 ml en otra nueva placa de microtitro conteniendo 100 ml de caldo por pozo y posteriormente incubadas durante 24 h. La concentración más baja sin crecimiento visible fue definida como CMB [28], lo que indica la muerte del 99,5% del inóculo original. La absorción de cada pozo fue medida a una longitud de onda de 620 nm por Microplate Manager 4.0 (laboratorios Bio-Rad) y comparada con un vacío. Solvente (DMSO) fue utilizado como control negativo. Se realizaron tres réplicas para cada compuesto y el experimento se repitió dos veces. Las bacterias utilizan sus proteasas de cisteína para la patogeneidad como podría ser representado a partir de la estructura de homólogo Cif en Burkholderia pseudomallei (CHBP) que revela un pliegue tipo papaína y una tríada catalítica conservada Cys-His-Gln [29]. Se ha demostrado que los patógenos bacterianos tienen una actividad hidrolítica única como papaína para bloquear la progresión normal del ciclo celular huésped como el núcleo de una proteína de avirulencia (Avr) (AvrPphB) del patógeno vegetal Pseudomonas syringae, se asemeja a las proteasasasas de cisteína tipo papaína. La similitud de esta proteína AvrPphB con papaína incluye la tríada catalítica de Cys-98, His-212, y Asp-227 en el sitio Turk et al. han propuesto, sobre la base de estudios cinéticos y estructurales, que la papaína tiene siete subsitios en el sitio activo, pero sólo cinco subsitios son importantes que pueden unirse a un residuo de aminoácidos del sustrato [31]. Una variedad de intermedios se generan cuando la papaína reacciona con el sustrato o un inhibidor [2]. Al igual que las proteasasas de serina, las proteasasas de cisteína tienden a tener sitios activos relativamente poco profundos, expuestos a disolventes, que pueden acomodar segmentos cortos de sustrato/inhibidores de bucles proteicos (por ejemplo, a partir de inhibidores endógenos como las cistatinas) o hebras. Tipo de inhibición Ki (mM) IC 50 (mM) Compuesto no competitivo 13,7 13.4 unido a la proteasa con una combinación de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Como parte de nuestra investigación en el desarrollo de nuevos y eficientes inhibidores de la proteasa cisteína, diez derivados de la piridilimidazo [1,5a] piridina sustituida (3a-j) fueron diseñados y analizados principalmente sobre la base de sus energías de acoplamiento contra la papaína para dilucidar su posible modo de acción. Se encontró que estos compuestos eran inhibidores específicos de la proteasa cisteína, papaína y no mostraron inhibición contra otros tipos de proteasasasasas como la serina, aspártica o metalloproteasas. Son específicos para el clan CA de la proteasa cisteína y no mostraron ninguna inhibición significativa contra otros clanes de proteasasasasas Estos nuevos compuestos fueron concebidos sobre la base del conocimiento de la capacidad de una proteína para alterar su conformación para acomodar un ligando de unión y nos permitió comparar directamente las posiciones relativas del residuo en el bolsillo de unión. El estudio de acoplamiento molecular proporcionó la visión estructural sobre la unión de estos compuestos (3a-j) (Figura 1) dentro del sitio activo de papaína que consiste principalmente en una tríada catalítica de Cys 25, Sus 159 y Asp 175 [32]. Además, el papel de otros residuos presentes en el sitio activo de papaína, jugando un papel importante en el alojamiento de compuestos también se han revelado. Inicialmente, el acoplamiento se realizó con todos los compuestos diseñados (3a-j) contra papaína, una conocida enzima de proteasa cisteína y en este contexto, observamos resultados muy interesantes donde nuestros inhibidores propuestos (3a-j) aprovechan los residuos aromáticos e hidrofílicos haciendo una variedad de Aunque los compuestos 3e-j dieron resultados significativos cuando se acoplaron con papaína pero durante la evaluación de las propiedades antibacterianas en experimentos de laboratorio húmedos, dieron resultados insignificantes (datos no mostrados).Por lo tanto, sólo cuatro compuestos fueron considerados para discusión y otros experimentos como estudios cinéticos y termodinámicos para caracterizar a estos compuestos como potentes pro-inhibidores (3a-d). Los hallazgos del estudio anterior han demostrado que las interacciones moleculares entre los compuestos 3a-d y papaína fueron muy similares a las interacciones observadas para E-64c, un derivado del inhibidor epóxido natural (E-64c) (Figura 1 ) de proteasasasas de cisteína [31, 32], con papaína; especialmente con respecto a la unión de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas de los ligandos con residuos conservados en el sitio de unión catalítica ( Varios residuos de papaína participaron en interacciones hidrofóbicas con compuestos 3a-d, incluyendo Gln19, Cys25, Gly66 y Asp158. Las propiedades de piridina de compuestos 3a-d interactúan con el sitio S2 de papaína, que incluye (Tyr61, Asn64, Gly65 y Tyr67) aminoácidos (Figura 2 A-D). Los residuos activos del sitio que se encontró que son un agente clave en la interacción de compuestos dentro del sitio activo (principalmente a través de interacciones hidrofóbicas) fueron Cys25, Tyr61, His159 y Trp177, mientras que Trp177, Gln19 fueron encontrados para mí haciendo enlaces de hidrógeno sólo con el compuesto 3a. Además de estos muchos otros residuos también se encontraron involucrados activamente (Tabla 1). Además, las energías de unión para el compuesto 3a, 3b, 3c y 3d con papaína se encontraron en 26.12, 25.76, 26.84 y 25.62 Kcal/mol respectivamente, que estuvieron en gran acuerdo con nuestros experimentos de laboratorio húmedo; se discutirán más adelante (Tabla 1). Esto confirmó la exactitud de nuestro protocolo de acoplamiento. Puesto que, la energía de unión es una medida directa de la fuerza de interacción y nuestros compuestos 3a-d mostraron una unión más fuerte dentro del sitio activo de papaína en comparación con el inhibidor E-64c (DG: 24.04 Kcal/mol), por lo tanto, los resultados sugieren que estos derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina (3ad) podrían ser inhibidores potentes de papaína como proteasasas de cisteína. La interacción en silico de compuestos 3a-d con papaína, observada como se ha comentado anteriormente, fue validada con laboratorio húmedo Tabla 5. La predicción de compuestos antibacterianos como fármacos (http://www.organical-chemistry.org). Tabla 2). Curiosamente, las energías de unión observadas en silico para los compuestos 3a-d contra papaína se encontraron en gran concordancia (error estándar 62 Kcal/mol) con el valor de energía libre de unión (DG) observado durante los estudios termodinámicos ( Tabla 1 y 2). Del mismo modo, el cambio entalpía (DH) de la unión fue negativo mientras que el cambio entropía (DS) de la unión fue positivo que indicó la naturaleza exotérmica y entropica de la unión. Este patrón de dependencia de la temperatura es característico de la interacción hidrofóbica [33]. Como se discutió anteriormente que todos los compuestos (3a-d) fueron encontrados para interactuar con los residuos activos del sitio de papaína a través de interacciones hidrofóbicas en la mayoría de los casos durante los estudios de silico, lo mismo fue observado por el análisis de las parcelas de Van't Hoff para todos los inhibidores propuestos a tres temperaturas diferentes (32uC, 37uC y 42uC) en experimentos de laboratorio húmedo (Figura 3). Esto demuestra la importancia de estos tipos de interacciones en el posicionamiento de compuestos dentro del sitio activo. Por lo tanto, la termodinámica así como en el estudio de silico revela que las interacciones hidrofóbicas favorecen la unión de estos inhibidores propuestos con papaína como proteasasasas de cisteína. En resumen, los resultados anteriores de estudios de acoplamiento molecular y análisis termodinámico de compuestos 3a-d con papaína mostraron que estos compuestos tienen el potencial de ser inhibidores de la proteasa cisteína novedosos y únicos. En el estudio actual, la actividad inhibidora de la proteasa cisteína de derivados sintetizados de 1 piridilimidazo substituido[1,5-a] piridina (3a-d)] también se realizó contra la papaína y se observaron constantes de inhibición (K i ) para la citada enzima 13,70, 23,20, 90,00 y 99,30 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Además, los valores calculados de IC 50 fueron también de 13,40, 21,17, 94,50 y 96,50 mM para los compuestos 3a, 3b, 3c y 3d respectivamente (Tabla 3). Excepto el compuesto 3b, el resto de los compuestos mostraron inhibiciones reversibles no competitivas, pero todos los compuestos, independientemente de los tipos de unión, mostraron interacción hidrofóbica y entrópicamente impulsada. Estos derivados (3a-j) fueron finalmente evaluados para sus actividades antibacterianas contra siete microbios clínicamente importantes (S. aureus, P. vulgaris, Grupo D Streptococci, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa y S. morganii). Aquí, estamos mostrando los datos de sólo cuatro compuestos (3a-d) debido a sus resultados significativos (Tabla 4). Todos los compuestos siguieron estrictamente el patrón de actividad antiproteasa hacia el crecimiento bacteriano excepto P. vulgaris y E. coli en una instancia cada uno (Tabla 4). Dado que los compuestos 3c y 3d no tienen mucha diferencia en sus valores IC50 (3c-94.5 mM y 3d-96.5 mM) contra la proteasa de cisteína, papaína y por lo tanto en la actividad antibacteriana en todos los casos excepto uno. Puede ser aleatorio debido a tan cerca en valores IC50. Compuestos 3c y 3d están teniendo mucha diferencia en sus valores IC50 (3b-21.17 mM y 3c-94.5 mM) y mostraron patrón exacto para su actividad antibacteriana para todos los microbios excepto E. coli en un caso. Aunque E. coli contiene seis proteasasas de cisteína principales pero ninguno pertenece al clan CA de papaína. Se argumenta que estos compuestos también inhibieron las proteas de cisteína de otros clanes pero con baja eficacia. Dado que los derivados de piridilimidazo[1,5-a]piridina son un andamio absolutamente nuevo hacia los agentes antibacterianos y, por lo tanto, no se dispone de ningún compuesto estándar del mismo andamio. Así, Clotrimazol (1-[(2-clorofenil)(difenil)metil]-1H-imidazol), un derivado imidazol y Ceftriaxona (antibio de cefalosporina de tercera generación con actividad de amplio espectro frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas) se han utilizado como control positivo, mientras que DMSO se ha utilizado como control negativo. Se observó que la concentración inhibitoria mínima (CMI) de compuestos (3a-d) (Tabla 4) frente a todas las bacterias probadas, excepto E. coli y P. vulgaris, estaba en gran acuerdo con sus respectivos valores constantes de inhibición (Ki)/IC 50 frente a la papaína (Tabla 3), lo que indica claramente que estos compuestos tienen el potencial de inhibir la papaína como las proteasasas de cisteína de estos patógenos. El coeficiente de partición (logP) es una medida bien establecida de la lipofilia del compuesto. La distribución de los valores de logP calculados (cLogP) de la mayoría de los fármacos en el mercado está en el rango de cero a cinco. Todos los compuestos estudiados excepto 3d, mostraron un buen acuerdo con los criterios establecidos para la predicción de un compuesto como fármaco potencial (Tabla 5). Todos los compuestos no muestran ninguna amenaza contra la evaluación del riesgo de toxicidad excepto el compuesto 3d que mostró una amenaza como efecto tumorógeno debido a la presencia de grupo de isobutilo. Entre todos los compuestos probados, el compuesto 3a fue el más potente cuyo MIC fue el más bajo de todos los compuestos probados y mostró una puntuación máxima de fármaco y valores positivos para la semejanza con el fármaco. En resumen, los resultados del presente estudio han establecido que los derivados piridilimidazo[1,5-a] de 1 sustituto podrían ser candidatos a inhibidores nuevos y potentes de papaína como las proteasasas de cisteína, que juegan un papel deletérgico en la progresión de diferentes enfermedades causadas por diversos microorganismos. Por lo tanto, este grupo de compuestos podría ser objeto de investigación futura para hacer frente a los desafíos con microorganismos resistentes que son una amenaza importante a nivel mundial.
|
¿Cuáles podrían ser los nuevos candidatos como potentes inhibidores de la papaína como las proteasasas de cisteína en microorganismos resistentes?
| false
| 3,044
|
{
"text": [
"1-substituted pyridylimidazo[1,5-a]pyridine derivatives"
],
"answer_start": [
22962
]
}
|
Derivados de 1-piridilimidazo[1,5-a]piridina sustituidos
|
641
|
Las plataformas terapéuticas de RNAi para las enfermedades pulmonareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816685/Fujita, Yu; Takeshita, Fumitaka; Kuwano, Kazuyoshi; Ochiya, Takahiro2013-02-06DOI:10.3390/ph6020223Licencia:cc-byAbstract: La interferencia del ARN (ARNi) se está convirtiendo rápidamente en un método importante para analizar las funciones genéticas en muchos eucariotas y promete el desarrollo de silenciamiento genético terapéutico. La inducción de RNAi se basa en los pequeños ARN silenciadores, que afectan a la degradación específica del ARN mensajero (ARNm). Los estudios de descubrimiento de fármacos y los tratamientos novedosos de los siRNAs están actualmente dirigidos a una amplia gama de enfermedades, incluyendo varias infecciones virales y cánceres. Las enfermedades pulmonares en general son blancos atractivos para las terapias de siRNAs debido a su letalidad y prevalencia. Además, el pulmón es accesible anatómicamente a los agentes terapéuticos a través de la vía intrapulmonar. Recientemente, la evidencia creciente indica que los miRNAs desempeñan un papel importante en las anomalías pulmonares, como la inflamación y la oncogénesis. Por lo tanto, los miRNAs están siendo dirigidos con fines terapéuticos. En esta revisión, presentamos estrategias para el parto de ARNi y discutimos el estado actual de la técnica RNAi basada en el arte para diversas enfermedades pulmonares. Texto: cirugía tradicional, Bivas-Benita et al. reportaron que no se produjo mortalidad como resultado del uso de Las aplicaciones endotraqueales están siendo utilizadas actualmente por muchos profesionales en el campo pulmonar [22, 34] ; esto es útil para estudiar la administración de fármacos pulmonares en ratones. Sin embargo, el enfoque es más complejo en humanos porque se utiliza una vía artificial para la entrega de medicamentos en los pulmones. Por lo tanto, el método se está utilizando en modelos animales para probar y evaluar su fiabilidad para posibles aplicaciones clínicas. Ruta intraqueal: bajo anestesia, la tráquea se expone quirúrgicamente, y se inserta un tubo o aguja a través de una incisión hecha entre los anillos traqueales. Complicaciones, tales como lesiones vasculares y fugas de aire, son posibles debido a la traqueotomía. b) Ruta endotraqueal: los siRNAs se rocian directamente desde la boca a los pulmones utilizando un aerolizador MicroSprayer ® (Penn-Century, Filadelfia, PA Es importante mantener una visión clara de la tráquea durante el procedimiento. El parto intranasal es otro método común de aplicación de fármacos pulmonares en estudios en animales. En muchos estudios, se ha demostrado éxito in vivo en la entrega de siRNAs a los pulmones intranasal [22, 35, 36 ]. Una configuración experimental de la entrega intranasal por pulverización o gotita es simple e indolora para el animal. Aunque el éxito en la entrega de siRNAs intranasal en roedores no puede ser completamente extrapolado al uso humano debido a las diferencias significativas en anatomía pulmonar [37], este enfoque tiene potencial para la aplicación clínica de siRNAs. Ensayos clínicos de fase II se han iniciado para el tratamiento de la infección por el virus sincitial respiratorio (RSV), haciendo uso de la aplicación intranasal de moléculas de siRNAs desnudas modificadas químicamente que se dirigen a los productos La entrada intranasal se ha utilizado durante mucho tiempo para administrar moléculas pequeñas, como proteínas, para el parto sistémico. Debido a que la mucosa nasal está altamente vascularizada, la entrega de un epitelio delgado de medicación a través de la superficie puede dar lugar a una rápida absorción del medicamento en la sangre. Por lo tanto, los siRNA administrados intranasalmente pueden depositarse en la nariz, y algunos de ellos pueden no poder llegar al tracto respiratorio inferior. De hecho, se ha informado que la aplicación intranasal de siRNAs no formulados dio lugar a una menor eficiencia de entrega y distribución pulmonar homogénea que la alcanzada con la aplicación intratraqueal [31]. El método intranasal es adecuado para algunas enfermedades pulmonares, como la infección respiratoria superior por VSR, y también tiene potencial para el parto sistémico en lugar de la entrega pulmonar de siRNAs. Por lo tanto, es importante considerar la vía de administración El uso de aerosoles para administrar medicamentos a los pulmones tiene un largo historial. La administración por inhalación es un método popular y no invasivo de administrar agentes a los pulmones. Hay varios dispositivos de inhalación disponibles para la entrega de medicamentos a los pulmones. Los inhaladores de dosis medidas (IDM) y los inhaladores de polvo seco (IDP) son los modos más comunes de administrar inhalación. Los inhaladores de dosis medidas son los inhaladores más utilizados para varias enfermedades pulmonares, como el asma, la bronquitis y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y un espaciador es un dispositivo externo que se une a una IDM para permitir una mejor administración de medicamentos mediante una mayor coordinación de la activación y la inhalación. Para la mayoría de los IDM, el propelente es uno o más gases llamados clorofluorocarbonos (CFC). Aunque los CFC en los medicamentos son seguros para que los pacientes inhalen, son perjudiciales para el medio ambiente. Por lo tanto, el desarrollo ulterior de los siRNA inhalables puede no ser la mejor manera de avanzar. Los DPI son dispositivos que entregan medicamentos a los pulmones en forma de polvo seco. El uso de los DPI ya ha demostrado ser prometedor para la entrega in vivo de macromoléculas terapéuticas como la insulina [39] y la heparina de bajo peso molecular [40] ; por lo tanto, podría ser un mejor dispositivo para la entrega de siRNAs a los pulmones. Las ventajas de los DPI son una mayor estabilidad y esterilidad de las biomoléculas sobre aerosoles líquidos y la formación libre de propelentes. Aunque los medicamentos se envían comúnmente a los pulmones por inhalación, la mayoría de los estudios in vivo que utilizan siRNAs se han basado en la entrega intratraqueal También se necesita un portador adecuado para proteger los ácidos nucleicos de la degradación debido a la fuerza de corte y al aumento de la temperatura durante el proceso de secado. Se ha demostrado el uso del secado por pulverización como técnica para la ingeniería de formulaciones en polvo seco de nanopartículas de siRNA, que podrían permitir la entrega local de siRNA biológicamente activo directamente al tejido pulmonar [24, 25]. En el futuro, la técnica es deseable para estimar el estudio in vivo sobre terapia de siRNA para inhalación. A largo plazo, anticipamos que habrá dispositivos más sofisticados para el uso clínico y que los que se están desarrollando serán más adecuados. Hay dos barreras principales para la entrega eficiente de siRNA pulmonar a las células del pulmón. La primera es la anatomía compleja y ramificada de los pulmones y barreras biomecánicas, como la capa de muco que cubre las células de las vías respiratorias [41, 42 La vía aérea consiste en bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y sacos alveolares. Todas estas estructuras contienen alvéolos, los diminutos sacos de aire en los que se produce el intercambio de gas. Generalmente se reconoce que el factor crítico para la entrega eficiente de siRNA depende de las propiedades de las partículas del fármaco ARNi en términos de tamaño, carga, forma, velocidad y densidad. Para la entrega eficiente de siRNA pulmonar, las partículas deben depositarse en el tracto respiratorio inferior. La deposición en la vía aérea se ve afectada por el tamaño de las partículas y la función pulmonar del paciente. Se encuentra que el tamaño de las partículas entre 1-5 μm es el más apropiado para la deposición en el tracto respiratorio inferior [23]. Además, la presencia de proteínas mucos y surfactantes, las acciones de aclaramiento mucociliar y la fagocitosis por Por lo tanto, los sistemas de parto generalmente requieren vectores de parto, y estos vectores necesitan ser diseñados con el fin de maximizar la deposición de siRNA en el área enferma del tracto respiratorio. Además, las barreras extracelulares al parto de siRNA también dependen de características fisiológicas del tracto respiratorio, que pueden cambiar con la enfermedad y características del paciente. En el estadio activo de la enfermedad pulmonar, las condiciones fisiológicas de las vías respiratorias podrían cambiar y tener un impacto significativo en la eficiencia del sistema de parto pulmonar. Durante la infección, inflamación y reacción alérgica, hay un aumento en la secreción de mucosidad junto con el aclaramiento mucociliar dañado [43]. Además, el asma y la EPOC son ambas condiciones inflamatorias crónicas del pulmón asociadas con "remodelación" estructural que no es apropiada para el mantenimiento de la función pulmonar normal [44]. Figura 2. Barreras extracelulares al parto de siRNA pulmonar. La característica anatómica del tracto respiratorio es su alto grado de ramificación. El moco alinea el epitelio respiratorio desde la cavidad nasal hasta los bronquios terminales. Las partículas depositadas en las células epiteliales ciliadas son rápidamente despejadas por las acciones de aclaramiento mucociliar. El muco y el aclaramiento mucociliar de las partículas atrapadas por mucosidad es un mecanismo de defensa pulmonar como barrera fisiológica. En las células alveolar, clara y alveolar tipo II se secretan en la superficie del epitelio alveolar, formando una capa delgada de surfactantes pulmonares. Los surfactantes actúan como barrera principal para el parto de siRNA porque reducen la eficiencia de la transfección. Además, los macrófagos ubicados en los alveolos absorbe Las partículas recogidas en los macrófagos se degradan posteriormente dentro de las células, los cuales presentan barreras importantes para el parto pulmonar dirigido; el segundo es el membrance de las células de las vías respiratorias y sus barreras intracelulares (Figura 3 ). Para el silenciamiento eficiente de los genes en los pulmones, los siRNAs deben ser entregados a su sitio de acción, ser estables, entrar en las células diana y estar presentes en el citoplasma a una concentración suficiente; una vez que los siRNAs alcanzan las células diana, deben ser transportados al citoplasma y llevados por Argonaute (Ago)2/complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que degrada los mRNAs y, posteriormente, suprime la expresión génica secuencia-específica; para que ocurra una endocitosis eficiente, las partículas deben tener un tamaño inferior a 150 nm. Las propiedades fisicoquímicas de los siRNA también juegan un papel significativo en el cruce de la membrana biológica. A pesar de su pequeño tamaño, la carga negativa y la degradabilidad química de las moléculas de siRNA les impiden cruzar fácilmente las membranas biológicas. Por lo tanto, los enfoques eficientes de siRNA necesitan superar esta limitación facilitando la captación celular. Una de las principales funciones de un vector de entrega es facilitar la captación celular de siRNA [46]. La complejación electrostática de moléculas de siRNA con lípidos y polímeros catiónicos ayuda a enmascarar su carga negativa neta. El complejo portador de siRNA con carga positiva interactúa con proteoglicanos aniónicos en la membrana celular, forma una vesícula endocítica, y entra en las células por endocitosis [47]. Después de la internalización celular, el complejo portador de siRNA en vesículas endocíticas es transportado a lo largo de microtúbulos a lisosomas que son colocalizados con el centro organizador de microtúbulos. Para evitar la degradación lisosómica, los siRNAs deben escapar del endosoma al citoplasma, donde pueden asociarse con la maquinaria ARNi. El escape endosomal es una barrera importante para la entrega eficiente de siRNA [48, 49]. El endosomal atrapamiento y la degradación lisosómica del siRNA y los portadores contribuyen a la baja eficiencia de transfección y es una dificultad importante para los vectores de entrega. Un agente de entrega ideal debe proteger los siRNAs de la degradación enzimática, facilitar la absorción celular, y promover la fuga endosomal dentro de las células con toxicidad insignificante. Se han reportado múltiples enfoques para la entrega de siRNAs, que van desde la administración directa relativamente simple de siRNAs con forma salina hasta enfoques de nanopartículas basadas en lípidos y polímeros y enfoques de conjugación y complejación de siRNAs [50]. La carga negativa y la degradabilidad química de los siRNAs bajo condiciones fisiológicamente relevantes hacen que su entrega sea un desafío importante. En consecuencia, la entrega de siRNAs generalmente requiere un vector o portadores para su transfección en las células diana. En general, se están evaluando vectores virales y no virales para la entrega de siRNAs a las células pulmonares. Algunos vectores virales, como retrovirus y adenovirus, han sido demostrados para mediar el silenciamiento genético en un modelo pulmonar in vitro [51] e inducir RNAi en una gama de tejidos animales [52]. Demostró que el siRNA mediado por lentivirus fue utilizado específicamente para derribar la expresión de la proteína nuclear 1 (NUPR1) in vivo, lo que resultó en un crecimiento tumoral inhibido [53]. Sin embargo, el parto basado en virus tiene varias desventajas. La respuesta inmune a los virus no sólo impide la entrega de genes sino que también tiene el potencial de causar complicaciones graves [54]. Casos recientes bien documentados, como la muerte de Jesse Gelsinger debido a complicaciones relacionadas con un vector de distribución adenoviral, destacan este problema [55]. Además, algunos vectores virales pueden insertar su genoma en posiciones aleatorias en el cromosoma huésped, lo que finalmente restringe la función génica [56].. Barreras intracelulares para la entrega de siRNA pulmonar. Las barreras a la internalización celular dependen de las propiedades superficiales del siRNA y los portadores (por ejemplo Después de que los siRNAs sean llevados exitosamente a las células diana por medio de endocitosis, las principales barreras para entregar siRNAs a su sitio de acción son la atrapación endosomal y la degradación lisosómica de siRNAs y portadores. Para dirigir el silenciamiento del gen diana, los siRNAs necesitan escapar del endosoma hacia el citoplasma, donde se asocian con el complejo silenciador inducido por Ago2/ARN (RISC) para dirigir la división de mRNAs con sitios de unión complementarios. Como alternativa a los vectores virales, los vectores no virales, incluyendo vectores basados en lípidos y polímeros, generalmente se han utilizado para la entrega de siRNAs a los pulmones debido a su toxicidad reducida [57]. Los vectores de entrega basados en lípidos se utilizan con éxito para producir siRNA in vitro e in vivo [58]. Los lípidos catiónicos están compuestos de cabeza cargada positivamente, un enlace e hidrofóbico. En general, los complejos basados en lípidos son fáciles de formular y se logra una buena eficacia de transfección debido a la interacción con la membrana celular cargada negativa. Muchos agentes de transfección de siRNA comerciales son sistemas de administración basados en lípidos, algunos de los cuales también se emplean para el parto pulmonar-DharmFECT [30], Oligofectamina [59], Lipofectamina [60] y TransIT-TKO [35]. Del mismo modo, los polímeros catiónicos también se han evaluado para la entrega de siRNA a las células pulmonares. Por otro lado, los vectores basados en lípidos también pueden inducir toxicidad y activación inespecífica de las respuestas inflamatorias de citocina e interferón [62, 63]. Aunque los vectores basados en polímero provocan una respuesta inmune relativamente menos fuerte que los vectores basados en lípidos, la administración efectiva de siRNA a un área local en enfermedades pulmonares requiere más atención al desarrollo de vectores de entrega no tóxicos. Un punto importante para la inhibición de la expresión génica mediada por siRNA es si los efectos observados son específicos y no debidos a efectos fuera de la meta y no están libres de respuestas potenciales de interferón [64, 65]. Curiosamente, algunos estudios han demostrado que fue posible administrar "siRNA desnuda" a ratones y regular un objetivo endógeno o exógeno sin inducir una respuesta de interferón [66]. Los siRNAs desnudos son degradados por las endonucleasas séricas y generalmente son eliminados por filtración glomerular, resultando en una corta semivida plasmática de < 10 min. Por lo tanto, algunos estudios de la entrega sistémica de siRNAs desnudos no han logrado reducir la regulación del gen objetivo [67, 68]. En contraste, también ha habido algunos éxitos en la entrega local de siRNAs desnudos a los pulmones [15, 16, 20, 31]. Algunos de ellos reportaron que el uso de vectores de distribución no mostró diferencia significativa en la eficiencia silenciadora de genes en comparación con la de los siRNAs desnudos [16, 35]. De hecho, en un ensayo clínico, se ha utilizado la entrega de siRNAs desnudos para el tratamiento de RSV [17, 38]. Esta evidencia exitosa puede ser debido a que los siRNAs desnudos para aplicaciones clínicas son altamente modificados químicamente para prevenir la degradación inducida por nucleasa y presumiblemente minimizar los efectos estimuladores inmunes. Aunque no está claro cómo los siRNAs desnudos cruzan la membrana celular, obtienen acceso al citoplasma y permanecen intactos para realizar su acción biológica, tanto los ensayos en animales como en humanos se han llevado a cabo exitosamente, mostrando la eficacia de los siRNAs desnudos (ALN-RSV01) que fueron administrados intranasalmente. Esta explicación no ha sido confirmada, pero el daño fisiológico de las células epiteliales respiratorias causadas por infección viral puede haber influido posiblemente en el misterio. El cambio activo en la membrana de células epiteliales de la vía aérea causada por enfermedad infecciosa podría afectar la internalización celular. Sin embargo, la ventaja de los siRNA desnudos sobre los vectores de parto en el tratamiento de enfermedades pulmonares es controvertida [69, 70]. Se requieren más investigaciones in vivo sobre los siRNA desnudos y los vectores no virales. La enfermedad pulmonar es una de las principales causas de muerte, y la disminución de la calidad de vida es responsable del sufrimiento de muchos pacientes. Varias enfermedades pulmonares hacen la vida extremadamente difícil para los pacientes, y los casos graves de estas enfermedades pulmonares pueden resultar en la muerte. Las altas tasas de muerte asociadas con el cáncer de pulmón se deben en parte al hecho de que es lamentablemente difícil de curar. Sobre todo, la EPOC es la cuarta causa de muerte en la mayoría de los países industrializados y se prevé que se convierta en tercera para 2020 [71]. Por lo tanto, se necesita una acción decisiva para frenar el aumento de la salud y la carga económica que esto representa. Las enfermedades pulmonares crónicas La aprobación de corticosteroides inhalados fue pionera en una nueva generación de terapia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, siendo la primera vez que se disponía de un producto antiinflamatorio para reducir la inflamación pulmonar característica en las vías respiratorias y la obstrucción asociada. Los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica. Sin embargo, se utilizan con limitaciones en la EPOC y asma de moderada a grave. Asimismo, el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares refractarias también depende de la terapia sistémica con corticosteroides. Muchos de estos pacientes también sufrieron diversos efectos secundarios del uso sistémico de corticosteroides, como aumento de peso e hiperglucemia no controlada. El tratamiento de la enfermedad pulmonar utilizando una orientación celular específica, así como técnicas RNAi, representan una estrategia novedosa y podrían proporcionar nuevas oportunidades en nanomedicina. Las aplicaciones pulmonares de siRNA in vivo son frecuentemente estudiadas y a menudo resultan en ensayos clínicos [57, 72]. Desde el descubrimiento de ARNi, el potencial terapéutico de los siRNAs ha sido rápidamente reconocido. En 2004, el primer ensayo clínico humano de terapia basada en ARNi se inició para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad con un siRNA dirigido al receptor de VEGF 1 entregado intravítreamente [73]. Se han realizado muchos estudios en los últimos años que involucran la entrega de siRNAs a los pulmones para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. La entrega a los pulmones será más importante para mover la tecnología de siRNAs a la clínica. Se están evaluando varias terapias basadas en siRNAs en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes condiciones, incluyendo enfermedades pulmonares como asma e infección por VSR. La Tabla 1 es un resumen de ensayos clínicos de terapias basadas en siRNAs [74]. El siRNA muestra potencial para el tratamiento de varias infecciones virales pulmonares, y se ha reportado que los tratamientos basados en el siRNA también pueden ser utilizados en el tratamiento de la gripe [13], el virus de la parainfluenza [35], el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) [14], y el VRS [35]. Sobre todo, el VRS es el objetivo terapéutico más prometedor de los siRNAs. El VRS es una causa común de infecciones respiratorias graves en lactantes y niños. También produce morbilidad y mortalidad significativas en poblaciones adultas inmunocomprometidas o ancianas [75]. No se dispone de una vacuna contra el VRS, y la única terapia antiviral aprobada para el VRS es indeseable para los pacientes pediátricos debido a su potencial teratogenicidad y eficacia limitada. El tratamiento basado en ARNi ha mostrado efectos prometedores en modelos murinos de infección por VRS [35]. El siRNA, ALN-RSV01, está dirigido contra el ARNm que codifica la proteína N del VRS que exhibe actividad anti-VRS específica in vitro e in vivo. Se entrega sin un vector de parto como aerosol nasal y se dirige al tracto respiratorio superior en lugar del área pulmonar inferior. ALN-RSV01 ha sido sometido a estudios completos de fase I intranasal e inhalación en adultos sanos y se ha encontrado que es generalmente bien tolerado [38]. Además, ALN-RSV01 ha sido evaluado en un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en pacientes trasplantados de pulmón con infección del tracto respiratorio RSV [76]. La administración de ALN-RSV01 a pacientes de trasplante de pulmón infectados por VRS fue segura y bien tolerada y asociada con una Basándose en estos resultados, se ha iniciado un ensayo multinacional más amplio, aleatorizado y doble ciego de fase IIb de ALN-RSV01 en pacientes con trasplante de pulmón para confirmar y extender estos hallazgos. El cáncer es un objetivo principal de la terapia basada en ARNi, ya que los oncogenes, los genes supresores de tumores mutados y varios otros genes que contribuyen a la progresión del tumor son objetivos potencialmente importantes para el silenciamiento de genes por ARNi. El cáncer de pulmón es uno de los tumores más frecuentes en todo el mundo con respecto a las tasas de incidencia y mortalidad. Los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican comúnmente en un estadio avanzado de la enfermedad y tienen opciones terapéuticas limitadas. La principal ventaja de la terapia ARNi en el cáncer podría ser la focalización simultánea de genes múltiples pertenecientes a diferentes vías celulares que participan en la progresión del tumor. La inhibición simultánea de varios genes también minimizaría el riesgo de resistencia a fármacos que normalmente se encuentran con terapias basadas en pequeñas moléculas, que involucran siRNAs y miRNAs. Ya ha habido mejoras significativas en los siRNAs para el tratamiento primario o metastásico del cáncer de pulmón al dirigirse a oncogenes como Akt1 [9], tumor de Wilms 1 (WT1) [12], genes sobreexpresados como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) [77], NUPR1 [53] y EZH2 [78]. Algunos de estos estudios han demostrado con éxito la eficacia de la terapia basada en ARNi mediante la administración intrapulmonar de siRNAs Aunque se deben diseñar estrategias para minimizar los efectos inmunoestimuladores fuera de objetivo y no específicos, estos datos sugieren que el silenciamiento del gen diana con siRNAs es una estrategia atractiva para la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón primario y metastásico. Actualmente hay algunos ensayos clínicos en curso que estiman la seguridad y eficacia de los fármacos basados en siRNAs para el tratamiento del cáncer. Atu027, un siRNA-lipoplex dirigido contra la proteína cinasa N3 (PKN3), previno la metástasis pulmonar en un ensayo de fase I de varios modelos de cáncer [79]. PKN3 es un efector aguas abajo de la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), que regula diversas respuestas celulares, incluyendo desarrollo, crecimiento y supervivencia [81]. Recientemente, PKN3 también ha sido considerado como una diana terapéutica adecuada para modular la angiogénesis tumoral debido a que la pérdida de análisis de función con Atu027 en células endoteliales primarias cultivadas mostró un papel esencial de PKN3 para la formación y migración de tubos endoteliales [79]. Atu027 puede ser considerado como un potencial siRNA para prevenir metástasis pulmonares y podría ser adecuado para prevenir metástasis hematógenas combinadas con terapia convencional del cáncer. La enfermedad pulmonar inflamatoria, también llamada EPOC, incluye una amplia gama de dolencias pulmonares. Estas enfermedades relacionadas incluyen asma, fibrosis pulmonar y bronquitis crónica. Están influenciadas por una combinación de componentes ambientales, genéticos y epigenéticos [82]. La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. La EPOC se asocia principalmente al tabaquismo, y estudios recientes que investigan la fisiopatología del enfisema han demostrado que el humo del cigarrillo puede causar que las células entren en la senescencia celular. Fumar puede causar senescencia a las células debido al daño del ADN a través del aumento del recambio celular, lo que a su vez conduce al acortamiento acelerado del telómero [84]. Últimamente, muchos estudios han investigado el papel de la senescencia celular en el desarrollo y la progresión de la EPOC [85]. Aunque varias clases de medicamentos, incluyendo corticosteroides inhalados, se utilizan para el tratamiento de la EPOC, ninguno de estos medicamentos ha demostrado mejorar significativamente la función pulmonar a largo plazo durante la progresión de la enfermedad. Muchas personas están desarrollando EPOC, y la causa de esta afección es complicada y no se comprende a fondo.Un factor clave es la susceptibilidad genética.Algunos estudios han mostrado una gran contribución genética a la variabilidad de la función pulmonar y EPOC [86, 87].Los polimorfismos en genes múltiples se han reportado asociados con EPOC [87], tales como factor de transcripción [por ejemplo factor nuclear-kappa B (NFoB)] [88], matriz extracelular (por ejemplo, matriz metaloproteinasa-12 (MMP-12)) [89, 90], citocinas [por ejemplo factor de necrosis tumoral (TNF)-α] [91], quimioquinas [por ejemplo. la interleucina (IL)-8, el receptor IL-8 y el receptor de quimiocina (CCR)1 [92, 93], y la apoptosis (por ejemplo, caspasa-3 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) [94, 95]. Muchos de ellos se han identificado como posibles blancos de la intervención terapéutica utilizando inhibidores de moléculas o antagonistas. Aunque varios tratamientos nuevos que se dirigen al proceso inflamatorio se encuentran ahora en desarrollo clínico, como inhibidores del TNF-α e inhibidores de la I-kappaB cinasa 2 (IKK2) [96, 97], los ensayos clínicos con siRNA nunca se han realizado en la EPOC. El retraso en el desarrollo de fármacos para la EPOC podría deberse a la aparición relativamente reciente de investigaciones que abordan la base molecular de la EPOC. Además, se necesitan más investigaciones para entender los mecanismos moleculares esenciales sobre la patogénesis de la EPOC y desarrollar técnicas de monitoreo para apoyar el desarrollo de terapias ARNi. Actualmente, no hay tratamientos disponibles que reduzcan la progresión de la EPOC o supriman la inflamación en las vías aéreas pequeñas y el parénquima pulmonar. El enfoque basado en los ARNi para las moléculas clave también tiene implicaciones potenciales para el tratamiento de la EPOC. El asma es también una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas caracterizada por síntomas variables y recurrentes y obstrucción reversible del flujo de aire. La Organización Mundial de la Salud estima que actualmente están afectadas 300 millones de personas y que, para el año 2025, otros 100 millones serán afectados por la enfermedad [98]. Los corticosteroides inhalados son muy eficaces en asma leve porque mejoran los síntomas y disminuyen las exacerbaciones. Aunque los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica para las enfermedades pulmonares inflamatorias, su uso no siempre es completamente efectivo y está asociado con efectos secundarios. Debido a estas limitaciones, está claro que hay una necesidad de nuevos tipos de medicamentos que pueden tratar y mejorar el pronóstico de asma moderada a grave. Se han identificado muchos genes diana que participan en la patogénesis del asma. Los objetivos más prometedores incluyen la codificación de genes para citoquinas (IL-4, IL5, IL-13), receptores de citoquinas y quimioquinas (IL-4 y CCR3), y tirosina quinasas [tirosina quinasa batida (Syk) y nuevas tirosina quinasa (Lyn) relacionadas con LCK/YES)], así como para factores de transcripción [transductores de señales y activadores de transcripción 1 (STAT1), STAT6, GATA3 y NF Actualmente, en un ensayo clínico para el asma, Excellair TM (ZaBeCor, Bala Cynwyd, PA, EE.UU.), se está utilizando un siRNA que se dirige a Syk. La cinasa está involucrada en la señalización de un receptor de células B y es un regulador clave de cascadas de señalización aguas abajo que en última instancia conducen a la activación de varios factores de transcripción proinflamatorios. Se ha reportado que los oligonucleótidos antisensibles administrados por aerosol fueron potentes para disminuir la expresión de Syk, liberación mediadora de macrófagos alveolares e inflamación pulmonar dependiente de Syk [102]. Además, se ha demostrado la inhibición de mediadores inflamatorios en un estudio utilizando siRNA dirigido a Syk en células epiteliales de vía aérea [103]. Algunos de los tratamientos actuales para el asma y otras condiciones inflamatorias, tales como inhibidores del TNF-α o inhibidores del leucotrieno, inhiben sólo uno de los mediadores de la inflamación. En contraste, el siRNA dirigido Syk busca inhibir un paso inicial de señalización de la inflamación y, por lo tanto, evitar la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. En general, el progreso reciente de los siRNAs a los pulmones también ha mejorado la viabilidad terapéutica de los ARNi para enfermedades pulmonares inflamatorias. El progreso rápido pondrá los tratamientos basados en el siRNA en una vía rápida a la clínica. MiRNAs son pequeños ARNs no codificantes endógenos que regulan la expresión génica reprimiendo la traducción o promoviendo la degradación de su mRNA objetivo. MiRNAs regulan la expresión génica mediante la unión a la 3′ región no traducida (UTR) de En el genoma humano, se estima que las transcripciones de aproximadamente el 60% de todos los ARNm están dirigidas por los miRNAs [104]. De acuerdo con su función, los miRNAs desempeñan un papel importante en los procesos celulares como desarrollo, proliferación y apoptosis de patologías pulmonares [105]. Se ha demostrado que un número creciente de miRNAs están involucrados en diferentes enfermedades pulmonares. Esta evidencia hace de los miRNAs una tecnología prometedora para el desarrollo terapéutico actual y futuro. Discutimos el papel de algunos miRNAs en diversas enfermedades pulmonares, así como el posible futuro de estos descubrimientos en aplicaciones clínicas.La Tabla 2 muestra el resumen de los miRNAs en el desarrollo terapéutico.En este punto, una terapia basada en miRNAs ya ha entrado en un ensayo clínico de fase II.Existe evidencia de que la regulación ascendente o descendente de los miRNAs es Muchos estudios se han centrado en el papel de los miRNAs en las enfermedades pulmonares inflamatorias, como la EPOC [116, 117], la fibrosis pulmonar [118] [118] [119] [129] y el asma [122] [123] [123] [125] [125] (Tabla 3). [130] [117, 129] La patogénesis de la EPOC se atribuye no sólo a la inflamación crónica en las vías respiratorias sino también a la inflamación sistémica [131]. El tabaquismo es el principal factor de riesgo para el desarrollo de la EPOC. Se ha demostrado que el tabaquismo causa cambios biológicos en la expresión génica de los pulmones [132], y hay algunos informes sobre los miRNAs relacionados con el tabaquismo [117, 129, 130]. Sin embargo, hay pocos informes que se centran en los miRNAs relacionados con la patogénesis de esta enfermedad con componentes inflamatorios sistémico El estudio reciente sobre fibroblastos pulmonares de pacientes con EPOC presenta menos expresión de miR-146a después de la estimulación con citocinas proinflamatorias en comparación con sujetos no EPOC con historias de tabaquismo similares [127]. La regulación descendente de miR-146a resultó en una vida media prolongada de ciclooxigenasa-2 del ARNm, aumentando así la prostaglandina E2 en fibroblastos de sujetos con EPOC. Además, Ezzie et al. investigaron la diferencia de perfiles de miRNA expresados en los pulmones de fumadores con y sin EPOC. Concluyeron que miR-223 y miR-1274a fueron los miRNA más afectados en sujetos con EPOC [126]. Sin embargo, la EPOC es un trastorno complejo, multicomponente y heterogéneo con una serie de diferentes procesos patológicos y subgrupos con sus propias características Se necesita una mejor comprensión de la complejidad de la enfermedad y de la potencial relevancia clínica de los miRNA identificados. La fibrosis pulmonar puede ser causada por una irritación identificable a los pulmones, pero en muchos casos se desconoce la causa, y las posibilidades terapéuticas son limitadas. El tabaquismo es uno de los factores de riesgo más reconocidos para el desarrollo de fibrosis pulmonar. Este trastorno se acompaña principalmente de una mayor expresión del mediador fibrótico clave que transforma el factor de crecimiento β (TGF-β) y otras citoquinas producidas en la lesión de fibrosis activa [128]. Recientemente, se informó que los miRNAs pueden desempeñar un papel regulador importante en el cambio fibromático pulmonar en los pulmones. La regulación descendente de let-7d en fibrosis pulmonar idiopática (IPF) resultó en un aumento de la deposición de colágeno y engrosamiento septal alveolar [119] En un modelo diferente de ratón asmático, se observó un aumento en la expresión de miR-21 en los pulmones [123]. Este informe podría contribuir a la comprensión del mecanismo inflamatorio en la vía aérea a través de la inhibición de IL-12, favoreciendo la respuesta de linfocitos Th2. Un receptor 4 (TLR4) inducido por Th2 induce una alta expresión de miR-126, y el bloqueo selectivo de miR-126 suprimió el fenotipo asmático [124]. Además, la remodelación de la vía aérea es una característica del asma y tiene importantes implicaciones funcionales. Rodríguez et al. han demostrado que miR-155 está relacionada con el desarrollo de infiltración inflamatoria en el pulmón y la remodelación de la vía aérea [122]. Así, algunos estudios presentan una conexión funcional entre la expresión de miRNA y la patogénesis del asma y sugieren que dirigir miRNA en las vías respiratorias puede conducir a tratamientos antiinflamatorios para el asma alérgica. A pesar de la evidencia de modelos experimentales, el perfil de expresión de miRNAs en biopsias de vías respiratorias de pacientes con asma leve antes y después del tratamiento con corticosteroides inhalados y en voluntarios sanos no reveló diferencias en la expresión de miRNAs [135]. Se requieren investigaciones adicionales sobre el papel de los miRNAs relacionados con la patogénesis del asma. Aunque la evidencia básica de la biología de miRNAs sigue proporcionando nuevas ideas, las aplicaciones de la terapia basada en miRNAs para enfermedades pulmonares inflamatorias son menos avanzadas que las del cáncer de pulmón [136]. Una razón de esto podría ser que la heterogeneidad de la enfermedad es causada por los efectos de muchos contaminantes ambientales del aire, incluyendo humo y compuestos orgánicos volátiles. La presencia de varios factores de riesgo complica la comprensión de la patogénesis de enfermedades pulmonares inflamatorias. La comprensión del papel que desempeñan los miRNAs en la modulación de la expresión génica, que conduce a sostener la patogénesis de las enfermedades pulmonares, es importante para el desarrollo de nuevas terapias que se centran en la prevención de la progresión de la enfermedad y el alivio de los síntomas. Dadas las importantes funciones que desempeñan los miRNAs en múltiples vías de carcinogénesis pulmonar, se están dedicando cada vez más esfuerzos a la investigación y desarrollo de terapias basadas en miRNAs, incluyendo la restauración de las funciones de miRNAs supresoras de tumores o la inhibición de miRNAs oncogénicos. El desarrollo de terapias basadas en miRNAs para el cáncer de pulmón está creciendo prósperamente con la ayuda de nuevas tecnologías ARNi. En comparación con las terapias basadas en siRNAs, que ya están en ensayos clínicos, los miRNAs son menos tóxicos y tienen el potencial de Los problemas críticos para el desarrollo de esta terapia son la entrega efectiva a los sitios de destino, la potencia de la terapia y la eliminación de los efectos fuera de la diana [137]. Hay dos estrategias como las aplicaciones terapéuticas de los miRNAs para el cáncer de pulmón [138]. Una estrategia es la terapia de reemplazo de miRNAs, que implica la reintroducción de un miRNA supresor tumoral imitado para restaurar una pérdida de la función. MiRNAs imitan a los duplex de ARN sintéticos diseñados para imitar las funciones endógenas de los miRNAs con modificaciones químicas para la estabilidad y la absorción celular. El concepto de terapia de reemplazo de miRNAs es más ejemplificado por el miRNAs let-7. let-7 es un miRNAs tumor-supresor en cáncer de pulmón no microcítico que se correlaciona inversamente con la expresión La administración intranasal de let-7 imitado en modelos de ratón de cáncer de pulmón redujo significativamente el crecimiento del tumor, lo que sugiere que la terapia de reemplazo de miRNA es realmente prometedora [106, 140, 141]. Otro miRNA que muestra el valor del reemplazo de miRNA es proporcionado por miR-34a [107, 142]. La administración local y/o sistémica de una miR-34a sintética imitada llevó a la acumulación de miR-34a en el tejido tumoral e inhibición del crecimiento del tumor pulmonar. Últimamente, Ling et al. también mostraron que el supresor miR-22 mostró actividad anti-cáncer pulmonar mediante la regulación post-transcripción de ErbB3 [143]. Así, las miRNA terapéuticas imitadas tienen un potencial poderoso atacando genes múltiples relevantes para varias enfermedades. Sin embargo, es necesario prestar atención a la toxicidad potencial en los tejidos normales en condiciones en las que la administración terapéutica de miRNA imita conducirá a una acumulación de miRNAs exógenos en células normales [138]. Aunque las suposiciones están bien fundadas, todavía hay evidencia insuficiente de toxicidad causada por miRNA imitaciones. De hecho, varios estudios in vivo fallaron en revelar efectos secundarios causados por los miRNA imitaciones y sugirió que la entrega de miRNA imitaciones a tejidos normales fue bien tolerada [107, 141]. Será importante investigar los efectos miRNAs imitados en células normales y evaluar cuidadosamente la toxicidad antes de utilizarlos en la práctica clínica. La segunda estrategia se dirige a una ganancia de función y tiene como objetivo inhibir oncomiRs mediante el uso de anti-miRNAs. Las modificaciones químicas, como el grupo 2'-O-metilo y el ácido nucleico bloqueado (LNA), aumentarían la estabilidad del oligo contra las nucleasas [144]. Los oligonucleótidos antisensibles contenidos en estas modificaciones se denominan antagomirs o "LNA-antimiRs" [144, 145]. Son oligonucleótidos con secuencias complementarias al miRNA endógeno e inhiben la función específica del miRNA. Se ha demostrado que un LNA-antimiR contra miR-122 silencia efectivamente miR-122 en primates no humanos [145], y los hallazgos apoyan el potencial de estos compuestos como una nueva clase terapéutica. Además, también se ha reportado que los anti-miR-150 suministrados en el tumor pulmonar xenoinjertos en ratones llevaron a un crecimiento tumoral inhibido En relación con estudios sobre miRNA imitados, estudios con oligonucleótidos antisensibles han mostrado evidencia efectiva con oligonucleótidos desnudos, lo que ilustra el potencial de modificaciones químicas de oligonucleótidos para mejorar su estabilidad, resistencia a la RNASa y propiedades farmacológicas, por lo que la inhibición de la función miRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificados se ha convertido en un enfoque importante y ampliamente utilizado. Datos recientes del primer estudio de fase II en pacientes con infección crónica por VHC tratados con el antimiR-122 modificado por LNA mostraron que este compuesto fue bien tolerado y proporcionó supresión viral continua. Un número creciente de estudios han examinado el potencial terapéutico de los miRNAs. Recientemente, ha surgido la evidencia de roles para miRNAs en la determinación de resistencia a fármacos [147]. En esta situación, la combinación de miRNA imita o antimiR con quimioterapia puede potenciar la eficacia del tratamiento del cáncer en el futuro. Además, los miRNA relacionados con las células madre cancerosas pueden ampliar significativamente el campo de la terapia basada en miRNA y sugerir que los miRNAs pueden ser herramientas potenciales para destruir las células cancerosas asociadas con la resistencia a la terapia, recurrencia y metástasis [108, 148]. Por lo tanto, el principal desafío es el suministro exitoso y las modificaciones químicas de los miRNAs terapéuticos al tejido objetivo sin dañar los tejidos normales. Los enfoques basados en ARNi proporcionan una modalidad terapéutica prometedora para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. Uno de los mayores desafíos en la terapia basada en ARNi sigue siendo el método de entrega de los siRNAs terapéuticos y miRNAs a las células objetivo. Las aplicaciones de parto pulmonar son muy atractivas, ya que tienden a ser no invasivas, son localmente restringidas y pueden ser administradas por el paciente. Una intervención terapéutica realista, como la aerosolización, puede mejorar la administración de fármacos en el lugar de acción y disminuir la exposición sistémica del paciente a la terapia, reduciendo así los efectos fuera de los objetivos. El avance de la entrega de siRNA pulmonar a la clínica ilustra que la terapia basada en ARNi ocupa un lugar central en el tratamiento futuro de las enfermedades pulmonares. Por otro lado, los miRNAs tienen la oportunidad de dirigir genes múltiples de una manera refinada, y la terapia basada en miRNA proporcionará un enfoque antitumoral y antiinflamatorio atractivo para diversas enfermedades pulmonares. En particular, la terapia antimiRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificado se ha convertido en una terapia potencial para las enfermedades pulmonares porque los oligonucleótidos El aumento de la evidencia ha indicado que los miRNA cumplen funciones causales en una variedad de enfermedades pulmonares y han impulsado investigaciones sobre su potencial como dianas terapéuticas. Para el desarrollo futuro se requieren una mayor comprensión de los mecanismos detallados de la terapia basada en ARNi y la investigación de métodos de parto más eficaces. Estos nuevos enfoques podrían abrir nuevas vías para diversas enfermedades pulmonares y mejorar el resultado clínico de los pacientes.
|
¿Qué método es útil en la administración de moléculas pequeñas para la entrega sistémica al cuerpo?
| false
| 1,612
|
{
"text": [
"Intranasal"
],
"answer_start": [
3238
]
}
|
Intranasal
|
641
|
Las plataformas terapéuticas de RNAi para las enfermedades pulmonareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816685/Fujita, Yu; Takeshita, Fumitaka; Kuwano, Kazuyoshi; Ochiya, Takahiro2013-02-06DOI:10.3390/ph6020223Licencia:cc-byAbstract: La interferencia del ARN (ARNi) se está convirtiendo rápidamente en un método importante para analizar las funciones genéticas en muchos eucariotas y promete el desarrollo de silenciamiento genético terapéutico. La inducción de RNAi se basa en los pequeños ARN silenciadores, que afectan a la degradación específica del ARN mensajero (ARNm). Los estudios de descubrimiento de fármacos y los tratamientos novedosos de los siRNAs están actualmente dirigidos a una amplia gama de enfermedades, incluyendo varias infecciones virales y cánceres. Las enfermedades pulmonares en general son blancos atractivos para las terapias de siRNAs debido a su letalidad y prevalencia. Además, el pulmón es accesible anatómicamente a los agentes terapéuticos a través de la vía intrapulmonar. Recientemente, la evidencia creciente indica que los miRNAs desempeñan un papel importante en las anomalías pulmonares, como la inflamación y la oncogénesis. Por lo tanto, los miRNAs están siendo dirigidos con fines terapéuticos. En esta revisión, presentamos estrategias para el parto de ARNi y discutimos el estado actual de la técnica RNAi basada en el arte para diversas enfermedades pulmonares. Texto: cirugía tradicional, Bivas-Benita et al. reportaron que no se produjo mortalidad como resultado del uso de Las aplicaciones endotraqueales están siendo utilizadas actualmente por muchos profesionales en el campo pulmonar [22, 34] ; esto es útil para estudiar la administración de fármacos pulmonares en ratones. Sin embargo, el enfoque es más complejo en humanos porque se utiliza una vía artificial para la entrega de medicamentos en los pulmones. Por lo tanto, el método se está utilizando en modelos animales para probar y evaluar su fiabilidad para posibles aplicaciones clínicas. Ruta intraqueal: bajo anestesia, la tráquea se expone quirúrgicamente, y se inserta un tubo o aguja a través de una incisión hecha entre los anillos traqueales. Complicaciones, tales como lesiones vasculares y fugas de aire, son posibles debido a la traqueotomía. b) Ruta endotraqueal: los siRNAs se rocian directamente desde la boca a los pulmones utilizando un aerolizador MicroSprayer ® (Penn-Century, Filadelfia, PA Es importante mantener una visión clara de la tráquea durante el procedimiento. El parto intranasal es otro método común de aplicación de fármacos pulmonares en estudios en animales. En muchos estudios, se ha demostrado éxito in vivo en la entrega de siRNAs a los pulmones intranasal [22, 35, 36 ]. Una configuración experimental de la entrega intranasal por pulverización o gotita es simple e indolora para el animal. Aunque el éxito en la entrega de siRNAs intranasal en roedores no puede ser completamente extrapolado al uso humano debido a las diferencias significativas en anatomía pulmonar [37], este enfoque tiene potencial para la aplicación clínica de siRNAs. Ensayos clínicos de fase II se han iniciado para el tratamiento de la infección por el virus sincitial respiratorio (RSV), haciendo uso de la aplicación intranasal de moléculas de siRNAs desnudas modificadas químicamente que se dirigen a los productos La entrada intranasal se ha utilizado durante mucho tiempo para administrar moléculas pequeñas, como proteínas, para el parto sistémico. Debido a que la mucosa nasal está altamente vascularizada, la entrega de un epitelio delgado de medicación a través de la superficie puede dar lugar a una rápida absorción del medicamento en la sangre. Por lo tanto, los siRNA administrados intranasalmente pueden depositarse en la nariz, y algunos de ellos pueden no poder llegar al tracto respiratorio inferior. De hecho, se ha informado que la aplicación intranasal de siRNAs no formulados dio lugar a una menor eficiencia de entrega y distribución pulmonar homogénea que la alcanzada con la aplicación intratraqueal [31]. El método intranasal es adecuado para algunas enfermedades pulmonares, como la infección respiratoria superior por VSR, y también tiene potencial para el parto sistémico en lugar de la entrega pulmonar de siRNAs. Por lo tanto, es importante considerar la vía de administración El uso de aerosoles para administrar medicamentos a los pulmones tiene un largo historial. La administración por inhalación es un método popular y no invasivo de administrar agentes a los pulmones. Hay varios dispositivos de inhalación disponibles para la entrega de medicamentos a los pulmones. Los inhaladores de dosis medidas (IDM) y los inhaladores de polvo seco (IDP) son los modos más comunes de administrar inhalación. Los inhaladores de dosis medidas son los inhaladores más utilizados para varias enfermedades pulmonares, como el asma, la bronquitis y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y un espaciador es un dispositivo externo que se une a una IDM para permitir una mejor administración de medicamentos mediante una mayor coordinación de la activación y la inhalación. Para la mayoría de los IDM, el propelente es uno o más gases llamados clorofluorocarbonos (CFC). Aunque los CFC en los medicamentos son seguros para que los pacientes inhalen, son perjudiciales para el medio ambiente. Por lo tanto, el desarrollo ulterior de los siRNA inhalables puede no ser la mejor manera de avanzar. Los DPI son dispositivos que entregan medicamentos a los pulmones en forma de polvo seco. El uso de los DPI ya ha demostrado ser prometedor para la entrega in vivo de macromoléculas terapéuticas como la insulina [39] y la heparina de bajo peso molecular [40] ; por lo tanto, podría ser un mejor dispositivo para la entrega de siRNAs a los pulmones. Las ventajas de los DPI son una mayor estabilidad y esterilidad de las biomoléculas sobre aerosoles líquidos y la formación libre de propelentes. Aunque los medicamentos se envían comúnmente a los pulmones por inhalación, la mayoría de los estudios in vivo que utilizan siRNAs se han basado en la entrega intratraqueal También se necesita un portador adecuado para proteger los ácidos nucleicos de la degradación debido a la fuerza de corte y al aumento de la temperatura durante el proceso de secado. Se ha demostrado el uso del secado por pulverización como técnica para la ingeniería de formulaciones en polvo seco de nanopartículas de siRNA, que podrían permitir la entrega local de siRNA biológicamente activo directamente al tejido pulmonar [24, 25]. En el futuro, la técnica es deseable para estimar el estudio in vivo sobre terapia de siRNA para inhalación. A largo plazo, anticipamos que habrá dispositivos más sofisticados para el uso clínico y que los que se están desarrollando serán más adecuados. Hay dos barreras principales para la entrega eficiente de siRNA pulmonar a las células del pulmón. La primera es la anatomía compleja y ramificada de los pulmones y barreras biomecánicas, como la capa de muco que cubre las células de las vías respiratorias [41, 42 La vía aérea consiste en bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y sacos alveolares. Todas estas estructuras contienen alvéolos, los diminutos sacos de aire en los que se produce el intercambio de gas. Generalmente se reconoce que el factor crítico para la entrega eficiente de siRNA depende de las propiedades de las partículas del fármaco ARNi en términos de tamaño, carga, forma, velocidad y densidad. Para la entrega eficiente de siRNA pulmonar, las partículas deben depositarse en el tracto respiratorio inferior. La deposición en la vía aérea se ve afectada por el tamaño de las partículas y la función pulmonar del paciente. Se encuentra que el tamaño de las partículas entre 1-5 μm es el más apropiado para la deposición en el tracto respiratorio inferior [23]. Además, la presencia de proteínas mucos y surfactantes, las acciones de aclaramiento mucociliar y la fagocitosis por Por lo tanto, los sistemas de parto generalmente requieren vectores de parto, y estos vectores necesitan ser diseñados con el fin de maximizar la deposición de siRNA en el área enferma del tracto respiratorio. Además, las barreras extracelulares al parto de siRNA también dependen de características fisiológicas del tracto respiratorio, que pueden cambiar con la enfermedad y características del paciente. En el estadio activo de la enfermedad pulmonar, las condiciones fisiológicas de las vías respiratorias podrían cambiar y tener un impacto significativo en la eficiencia del sistema de parto pulmonar. Durante la infección, inflamación y reacción alérgica, hay un aumento en la secreción de mucosidad junto con el aclaramiento mucociliar dañado [43]. Además, el asma y la EPOC son ambas condiciones inflamatorias crónicas del pulmón asociadas con "remodelación" estructural que no es apropiada para el mantenimiento de la función pulmonar normal [44]. Figura 2. Barreras extracelulares al parto de siRNA pulmonar. La característica anatómica del tracto respiratorio es su alto grado de ramificación. El moco alinea el epitelio respiratorio desde la cavidad nasal hasta los bronquios terminales. Las partículas depositadas en las células epiteliales ciliadas son rápidamente despejadas por las acciones de aclaramiento mucociliar. El muco y el aclaramiento mucociliar de las partículas atrapadas por mucosidad es un mecanismo de defensa pulmonar como barrera fisiológica. En las células alveolar, clara y alveolar tipo II se secretan en la superficie del epitelio alveolar, formando una capa delgada de surfactantes pulmonares. Los surfactantes actúan como barrera principal para el parto de siRNA porque reducen la eficiencia de la transfección. Además, los macrófagos ubicados en los alveolos absorbe Las partículas recogidas en los macrófagos se degradan posteriormente dentro de las células, los cuales presentan barreras importantes para el parto pulmonar dirigido; el segundo es el membrance de las células de las vías respiratorias y sus barreras intracelulares (Figura 3 ). Para el silenciamiento eficiente de los genes en los pulmones, los siRNAs deben ser entregados a su sitio de acción, ser estables, entrar en las células diana y estar presentes en el citoplasma a una concentración suficiente; una vez que los siRNAs alcanzan las células diana, deben ser transportados al citoplasma y llevados por Argonaute (Ago)2/complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que degrada los mRNAs y, posteriormente, suprime la expresión génica secuencia-específica; para que ocurra una endocitosis eficiente, las partículas deben tener un tamaño inferior a 150 nm. Las propiedades fisicoquímicas de los siRNA también juegan un papel significativo en el cruce de la membrana biológica. A pesar de su pequeño tamaño, la carga negativa y la degradabilidad química de las moléculas de siRNA les impiden cruzar fácilmente las membranas biológicas. Por lo tanto, los enfoques eficientes de siRNA necesitan superar esta limitación facilitando la captación celular. Una de las principales funciones de un vector de entrega es facilitar la captación celular de siRNA [46]. La complejación electrostática de moléculas de siRNA con lípidos y polímeros catiónicos ayuda a enmascarar su carga negativa neta. El complejo portador de siRNA con carga positiva interactúa con proteoglicanos aniónicos en la membrana celular, forma una vesícula endocítica, y entra en las células por endocitosis [47]. Después de la internalización celular, el complejo portador de siRNA en vesículas endocíticas es transportado a lo largo de microtúbulos a lisosomas que son colocalizados con el centro organizador de microtúbulos. Para evitar la degradación lisosómica, los siRNAs deben escapar del endosoma al citoplasma, donde pueden asociarse con la maquinaria ARNi. El escape endosomal es una barrera importante para la entrega eficiente de siRNA [48, 49]. El endosomal atrapamiento y la degradación lisosómica del siRNA y los portadores contribuyen a la baja eficiencia de transfección y es una dificultad importante para los vectores de entrega. Un agente de entrega ideal debe proteger los siRNAs de la degradación enzimática, facilitar la absorción celular, y promover la fuga endosomal dentro de las células con toxicidad insignificante. Se han reportado múltiples enfoques para la entrega de siRNAs, que van desde la administración directa relativamente simple de siRNAs con forma salina hasta enfoques de nanopartículas basadas en lípidos y polímeros y enfoques de conjugación y complejación de siRNAs [50]. La carga negativa y la degradabilidad química de los siRNAs bajo condiciones fisiológicamente relevantes hacen que su entrega sea un desafío importante. En consecuencia, la entrega de siRNAs generalmente requiere un vector o portadores para su transfección en las células diana. En general, se están evaluando vectores virales y no virales para la entrega de siRNAs a las células pulmonares. Algunos vectores virales, como retrovirus y adenovirus, han sido demostrados para mediar el silenciamiento genético en un modelo pulmonar in vitro [51] e inducir RNAi en una gama de tejidos animales [52]. Demostró que el siRNA mediado por lentivirus fue utilizado específicamente para derribar la expresión de la proteína nuclear 1 (NUPR1) in vivo, lo que resultó en un crecimiento tumoral inhibido [53]. Sin embargo, el parto basado en virus tiene varias desventajas. La respuesta inmune a los virus no sólo impide la entrega de genes sino que también tiene el potencial de causar complicaciones graves [54]. Casos recientes bien documentados, como la muerte de Jesse Gelsinger debido a complicaciones relacionadas con un vector de distribución adenoviral, destacan este problema [55]. Además, algunos vectores virales pueden insertar su genoma en posiciones aleatorias en el cromosoma huésped, lo que finalmente restringe la función génica [56].. Barreras intracelulares para la entrega de siRNA pulmonar. Las barreras a la internalización celular dependen de las propiedades superficiales del siRNA y los portadores (por ejemplo Después de que los siRNAs sean llevados exitosamente a las células diana por medio de endocitosis, las principales barreras para entregar siRNAs a su sitio de acción son la atrapación endosomal y la degradación lisosómica de siRNAs y portadores. Para dirigir el silenciamiento del gen diana, los siRNAs necesitan escapar del endosoma hacia el citoplasma, donde se asocian con el complejo silenciador inducido por Ago2/ARN (RISC) para dirigir la división de mRNAs con sitios de unión complementarios. Como alternativa a los vectores virales, los vectores no virales, incluyendo vectores basados en lípidos y polímeros, generalmente se han utilizado para la entrega de siRNAs a los pulmones debido a su toxicidad reducida [57]. Los vectores de entrega basados en lípidos se utilizan con éxito para producir siRNA in vitro e in vivo [58]. Los lípidos catiónicos están compuestos de cabeza cargada positivamente, un enlace e hidrofóbico. En general, los complejos basados en lípidos son fáciles de formular y se logra una buena eficacia de transfección debido a la interacción con la membrana celular cargada negativa. Muchos agentes de transfección de siRNA comerciales son sistemas de administración basados en lípidos, algunos de los cuales también se emplean para el parto pulmonar-DharmFECT [30], Oligofectamina [59], Lipofectamina [60] y TransIT-TKO [35]. Del mismo modo, los polímeros catiónicos también se han evaluado para la entrega de siRNA a las células pulmonares. Por otro lado, los vectores basados en lípidos también pueden inducir toxicidad y activación inespecífica de las respuestas inflamatorias de citocina e interferón [62, 63]. Aunque los vectores basados en polímero provocan una respuesta inmune relativamente menos fuerte que los vectores basados en lípidos, la administración efectiva de siRNA a un área local en enfermedades pulmonares requiere más atención al desarrollo de vectores de entrega no tóxicos. Un punto importante para la inhibición de la expresión génica mediada por siRNA es si los efectos observados son específicos y no debidos a efectos fuera de la meta y no están libres de respuestas potenciales de interferón [64, 65]. Curiosamente, algunos estudios han demostrado que fue posible administrar "siRNA desnuda" a ratones y regular un objetivo endógeno o exógeno sin inducir una respuesta de interferón [66]. Los siRNAs desnudos son degradados por las endonucleasas séricas y generalmente son eliminados por filtración glomerular, resultando en una corta semivida plasmática de < 10 min. Por lo tanto, algunos estudios de la entrega sistémica de siRNAs desnudos no han logrado reducir la regulación del gen objetivo [67, 68]. En contraste, también ha habido algunos éxitos en la entrega local de siRNAs desnudos a los pulmones [15, 16, 20, 31]. Algunos de ellos reportaron que el uso de vectores de distribución no mostró diferencia significativa en la eficiencia silenciadora de genes en comparación con la de los siRNAs desnudos [16, 35]. De hecho, en un ensayo clínico, se ha utilizado la entrega de siRNAs desnudos para el tratamiento de RSV [17, 38]. Esta evidencia exitosa puede ser debido a que los siRNAs desnudos para aplicaciones clínicas son altamente modificados químicamente para prevenir la degradación inducida por nucleasa y presumiblemente minimizar los efectos estimuladores inmunes. Aunque no está claro cómo los siRNAs desnudos cruzan la membrana celular, obtienen acceso al citoplasma y permanecen intactos para realizar su acción biológica, tanto los ensayos en animales como en humanos se han llevado a cabo exitosamente, mostrando la eficacia de los siRNAs desnudos (ALN-RSV01) que fueron administrados intranasalmente. Esta explicación no ha sido confirmada, pero el daño fisiológico de las células epiteliales respiratorias causadas por infección viral puede haber influido posiblemente en el misterio. El cambio activo en la membrana de células epiteliales de la vía aérea causada por enfermedad infecciosa podría afectar la internalización celular. Sin embargo, la ventaja de los siRNA desnudos sobre los vectores de parto en el tratamiento de enfermedades pulmonares es controvertida [69, 70]. Se requieren más investigaciones in vivo sobre los siRNA desnudos y los vectores no virales. La enfermedad pulmonar es una de las principales causas de muerte, y la disminución de la calidad de vida es responsable del sufrimiento de muchos pacientes. Varias enfermedades pulmonares hacen la vida extremadamente difícil para los pacientes, y los casos graves de estas enfermedades pulmonares pueden resultar en la muerte. Las altas tasas de muerte asociadas con el cáncer de pulmón se deben en parte al hecho de que es lamentablemente difícil de curar. Sobre todo, la EPOC es la cuarta causa de muerte en la mayoría de los países industrializados y se prevé que se convierta en tercera para 2020 [71]. Por lo tanto, se necesita una acción decisiva para frenar el aumento de la salud y la carga económica que esto representa. Las enfermedades pulmonares crónicas La aprobación de corticosteroides inhalados fue pionera en una nueva generación de terapia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, siendo la primera vez que se disponía de un producto antiinflamatorio para reducir la inflamación pulmonar característica en las vías respiratorias y la obstrucción asociada. Los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica. Sin embargo, se utilizan con limitaciones en la EPOC y asma de moderada a grave. Asimismo, el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares refractarias también depende de la terapia sistémica con corticosteroides. Muchos de estos pacientes también sufrieron diversos efectos secundarios del uso sistémico de corticosteroides, como aumento de peso e hiperglucemia no controlada. El tratamiento de la enfermedad pulmonar utilizando una orientación celular específica, así como técnicas RNAi, representan una estrategia novedosa y podrían proporcionar nuevas oportunidades en nanomedicina. Las aplicaciones pulmonares de siRNA in vivo son frecuentemente estudiadas y a menudo resultan en ensayos clínicos [57, 72]. Desde el descubrimiento de ARNi, el potencial terapéutico de los siRNAs ha sido rápidamente reconocido. En 2004, el primer ensayo clínico humano de terapia basada en ARNi se inició para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad con un siRNA dirigido al receptor de VEGF 1 entregado intravítreamente [73]. Se han realizado muchos estudios en los últimos años que involucran la entrega de siRNAs a los pulmones para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. La entrega a los pulmones será más importante para mover la tecnología de siRNAs a la clínica. Se están evaluando varias terapias basadas en siRNAs en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes condiciones, incluyendo enfermedades pulmonares como asma e infección por VSR. La Tabla 1 es un resumen de ensayos clínicos de terapias basadas en siRNAs [74]. El siRNA muestra potencial para el tratamiento de varias infecciones virales pulmonares, y se ha reportado que los tratamientos basados en el siRNA también pueden ser utilizados en el tratamiento de la gripe [13], el virus de la parainfluenza [35], el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) [14], y el VRS [35]. Sobre todo, el VRS es el objetivo terapéutico más prometedor de los siRNAs. El VRS es una causa común de infecciones respiratorias graves en lactantes y niños. También produce morbilidad y mortalidad significativas en poblaciones adultas inmunocomprometidas o ancianas [75]. No se dispone de una vacuna contra el VRS, y la única terapia antiviral aprobada para el VRS es indeseable para los pacientes pediátricos debido a su potencial teratogenicidad y eficacia limitada. El tratamiento basado en ARNi ha mostrado efectos prometedores en modelos murinos de infección por VRS [35]. El siRNA, ALN-RSV01, está dirigido contra el ARNm que codifica la proteína N del VRS que exhibe actividad anti-VRS específica in vitro e in vivo. Se entrega sin un vector de parto como aerosol nasal y se dirige al tracto respiratorio superior en lugar del área pulmonar inferior. ALN-RSV01 ha sido sometido a estudios completos de fase I intranasal e inhalación en adultos sanos y se ha encontrado que es generalmente bien tolerado [38]. Además, ALN-RSV01 ha sido evaluado en un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en pacientes trasplantados de pulmón con infección del tracto respiratorio RSV [76]. La administración de ALN-RSV01 a pacientes de trasplante de pulmón infectados por VRS fue segura y bien tolerada y asociada con una Basándose en estos resultados, se ha iniciado un ensayo multinacional más amplio, aleatorizado y doble ciego de fase IIb de ALN-RSV01 en pacientes con trasplante de pulmón para confirmar y extender estos hallazgos. El cáncer es un objetivo principal de la terapia basada en ARNi, ya que los oncogenes, los genes supresores de tumores mutados y varios otros genes que contribuyen a la progresión del tumor son objetivos potencialmente importantes para el silenciamiento de genes por ARNi. El cáncer de pulmón es uno de los tumores más frecuentes en todo el mundo con respecto a las tasas de incidencia y mortalidad. Los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican comúnmente en un estadio avanzado de la enfermedad y tienen opciones terapéuticas limitadas. La principal ventaja de la terapia ARNi en el cáncer podría ser la focalización simultánea de genes múltiples pertenecientes a diferentes vías celulares que participan en la progresión del tumor. La inhibición simultánea de varios genes también minimizaría el riesgo de resistencia a fármacos que normalmente se encuentran con terapias basadas en pequeñas moléculas, que involucran siRNAs y miRNAs. Ya ha habido mejoras significativas en los siRNAs para el tratamiento primario o metastásico del cáncer de pulmón al dirigirse a oncogenes como Akt1 [9], tumor de Wilms 1 (WT1) [12], genes sobreexpresados como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) [77], NUPR1 [53] y EZH2 [78]. Algunos de estos estudios han demostrado con éxito la eficacia de la terapia basada en ARNi mediante la administración intrapulmonar de siRNAs Aunque se deben diseñar estrategias para minimizar los efectos inmunoestimuladores fuera de objetivo y no específicos, estos datos sugieren que el silenciamiento del gen diana con siRNAs es una estrategia atractiva para la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón primario y metastásico. Actualmente hay algunos ensayos clínicos en curso que estiman la seguridad y eficacia de los fármacos basados en siRNAs para el tratamiento del cáncer. Atu027, un siRNA-lipoplex dirigido contra la proteína cinasa N3 (PKN3), previno la metástasis pulmonar en un ensayo de fase I de varios modelos de cáncer [79]. PKN3 es un efector aguas abajo de la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), que regula diversas respuestas celulares, incluyendo desarrollo, crecimiento y supervivencia [81]. Recientemente, PKN3 también ha sido considerado como una diana terapéutica adecuada para modular la angiogénesis tumoral debido a que la pérdida de análisis de función con Atu027 en células endoteliales primarias cultivadas mostró un papel esencial de PKN3 para la formación y migración de tubos endoteliales [79]. Atu027 puede ser considerado como un potencial siRNA para prevenir metástasis pulmonares y podría ser adecuado para prevenir metástasis hematógenas combinadas con terapia convencional del cáncer. La enfermedad pulmonar inflamatoria, también llamada EPOC, incluye una amplia gama de dolencias pulmonares. Estas enfermedades relacionadas incluyen asma, fibrosis pulmonar y bronquitis crónica. Están influenciadas por una combinación de componentes ambientales, genéticos y epigenéticos [82]. La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. La EPOC se asocia principalmente al tabaquismo, y estudios recientes que investigan la fisiopatología del enfisema han demostrado que el humo del cigarrillo puede causar que las células entren en la senescencia celular. Fumar puede causar senescencia a las células debido al daño del ADN a través del aumento del recambio celular, lo que a su vez conduce al acortamiento acelerado del telómero [84]. Últimamente, muchos estudios han investigado el papel de la senescencia celular en el desarrollo y la progresión de la EPOC [85]. Aunque varias clases de medicamentos, incluyendo corticosteroides inhalados, se utilizan para el tratamiento de la EPOC, ninguno de estos medicamentos ha demostrado mejorar significativamente la función pulmonar a largo plazo durante la progresión de la enfermedad. Muchas personas están desarrollando EPOC, y la causa de esta afección es complicada y no se comprende a fondo.Un factor clave es la susceptibilidad genética.Algunos estudios han mostrado una gran contribución genética a la variabilidad de la función pulmonar y EPOC [86, 87].Los polimorfismos en genes múltiples se han reportado asociados con EPOC [87], tales como factor de transcripción [por ejemplo factor nuclear-kappa B (NFoB)] [88], matriz extracelular (por ejemplo, matriz metaloproteinasa-12 (MMP-12)) [89, 90], citocinas [por ejemplo factor de necrosis tumoral (TNF)-α] [91], quimioquinas [por ejemplo. la interleucina (IL)-8, el receptor IL-8 y el receptor de quimiocina (CCR)1 [92, 93], y la apoptosis (por ejemplo, caspasa-3 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) [94, 95]. Muchos de ellos se han identificado como posibles blancos de la intervención terapéutica utilizando inhibidores de moléculas o antagonistas. Aunque varios tratamientos nuevos que se dirigen al proceso inflamatorio se encuentran ahora en desarrollo clínico, como inhibidores del TNF-α e inhibidores del complejo I-kappaB cinasa 2 (IKK2) [96, 97], los ensayos clínicos con siRNA nunca se han realizado en la EPOC. El retraso en el desarrollo de fármacos para la EPOC podría deberse a la aparición relativamente reciente de investigaciones que abordan la base molecular de la EPOC. Además, se necesitan más investigaciones para entender los mecanismos moleculares esenciales sobre la patogénesis de la EPOC y desarrollar técnicas de monitoreo para apoyar el desarrollo de terapias ARNi. Actualmente, no hay tratamientos disponibles que reduzcan la progresión de la EPOC o supriman la inflamación en las vías aéreas pequeñas y el parénquima pulmonar. El enfoque basado en los ARNi para las moléculas clave también tiene implicaciones potenciales para el tratamiento de la EPOC. El asma es también una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas caracterizada por síntomas variables y recurrentes y obstrucción reversible del flujo de aire. La Organización Mundial de la Salud estima que actualmente están afectadas 300 millones de personas y que, para el año 2025, otros 100 millones serán afectados por la enfermedad [98]. Los corticosteroides inhalados son muy eficaces en asma leve porque mejoran los síntomas y disminuyen las exacerbaciones. Aunque los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica para las enfermedades pulmonares inflamatorias, su uso no siempre es completamente efectivo y está asociado con efectos secundarios. Debido a estas limitaciones, está claro que hay una necesidad de nuevos tipos de medicamentos que pueden tratar y mejorar el pronóstico de asma moderada a grave. Se han identificado muchos genes diana que participan en la patogénesis del asma. Los objetivos más prometedores incluyen la codificación de genes para citoquinas (IL-4, IL5, IL-13), receptores de citoquinas y quimioquinas (IL-4 y CCR3), y tirosina quinasas [tirosina quinasa batida (Syk) y nuevas tirosina quinasa (Lyn) relacionadas con LCK/YES)], así como para factores de transcripción [transductores de señales y activadores de transcripción 1 (STAT1), STAT6, GATA3 y NF Actualmente, en un ensayo clínico para el asma, Excellair TM (ZaBeCor, Bala Cynwyd, PA, EE.UU.), se está utilizando un siRNA que se dirige a Syk. La cinasa está involucrada en la señalización de un receptor de células B y es un regulador clave de cascadas de señalización aguas abajo que en última instancia conducen a la activación de varios factores de transcripción proinflamatorios. Se ha reportado que los oligonucleótidos antisensibles administrados por aerosol fueron potentes para disminuir la expresión de Syk, liberación mediadora de macrófagos alveolares e inflamación pulmonar dependiente de Syk [102]. Además, se ha demostrado la inhibición de mediadores inflamatorios en un estudio utilizando siRNA dirigido a Syk en células epiteliales de vía aérea [103]. Algunos de los tratamientos actuales para el asma y otras condiciones inflamatorias, tales como inhibidores del TNF-α o inhibidores del leucotrieno, inhiben sólo uno de los mediadores de la inflamación. En contraste, el siRNA dirigido Syk busca inhibir un paso inicial de señalización de la inflamación y, por lo tanto, evitar la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. En general, el progreso reciente de los siRNAs a los pulmones también ha mejorado la viabilidad terapéutica de los ARNi para enfermedades pulmonares inflamatorias. El progreso rápido pondrá los tratamientos basados en el siRNA en una vía rápida a la clínica. MiRNAs son pequeños ARNs no codificantes endógenos que regulan la expresión génica reprimiendo la traducción o promoviendo la degradación de su mRNA objetivo. MiRNAs regulan la expresión génica mediante la unión a la 3′ región no traducida (UTR) de En el genoma humano, se estima que las transcripciones de aproximadamente el 60% de todos los ARNm están dirigidas por los miRNAs [104]. De acuerdo con su función, los miRNAs desempeñan un papel importante en los procesos celulares como desarrollo, proliferación y apoptosis de patologías pulmonares [105]. Se ha demostrado que un número creciente de miRNAs están involucrados en diferentes enfermedades pulmonares. Esta evidencia hace de los miRNAs una tecnología prometedora para el desarrollo terapéutico actual y futuro. Discutimos el papel de algunos miRNAs en diversas enfermedades pulmonares, así como el posible futuro de estos descubrimientos en aplicaciones clínicas.La Tabla 2 muestra el resumen de los miRNAs en el desarrollo terapéutico.En este punto, una terapia basada en miRNAs ya ha entrado en un ensayo clínico de fase II.Existe evidencia de que la regulación ascendente o descendente de los miRNAs es Muchos estudios se han centrado en el papel de los miRNAs en las enfermedades pulmonares inflamatorias, como la EPOC [116, 117], la fibrosis pulmonar [118] [118] [119] [129] y el asma [122] [123] [123] [125] [125] (Tabla 3). [130] [117, 129] La patogénesis de la EPOC se atribuye no sólo a la inflamación crónica en las vías respiratorias sino también a la inflamación sistémica [131]. El tabaquismo es el principal factor de riesgo para el desarrollo de la EPOC. Se ha demostrado que el tabaquismo causa cambios biológicos en la expresión génica de los pulmones [132], y hay algunos informes sobre los miRNAs relacionados con el tabaquismo [117, 129, 130]. Sin embargo, hay pocos informes que se centran en los miRNAs relacionados con la patogénesis de esta enfermedad con componentes inflamatorios sistémico El estudio reciente sobre fibroblastos pulmonares de pacientes con EPOC presenta menos expresión de miR-146a después de la estimulación con citocinas proinflamatorias en comparación con sujetos no EPOC con historias de tabaquismo similares [127]. La regulación descendente de miR-146a resultó en una vida media prolongada de ciclooxigenasa-2 del ARNm, aumentando así la prostaglandina E2 en fibroblastos de sujetos con EPOC. Además, Ezzie et al. investigaron la diferencia de perfiles de miRNA expresados en los pulmones de fumadores con y sin EPOC. Concluyeron que miR-223 y miR-1274a fueron los miRNA más afectados en sujetos con EPOC [126]. Sin embargo, la EPOC es un trastorno complejo, multicomponente y heterogéneo con una serie de diferentes procesos patológicos y subgrupos con sus propias características Se necesita una mejor comprensión de la complejidad de la enfermedad y de la potencial relevancia clínica de los miRNA identificados. La fibrosis pulmonar puede ser causada por una irritación identificable a los pulmones, pero en muchos casos se desconoce la causa, y las posibilidades terapéuticas son limitadas. El tabaquismo es uno de los factores de riesgo más reconocidos para el desarrollo de fibrosis pulmonar. Este trastorno se acompaña principalmente de una mayor expresión del mediador fibrótico clave que transforma el factor de crecimiento β (TGF-β) y otras citoquinas producidas en la lesión de fibrosis activa [128]. Recientemente, se informó que los miRNAs pueden desempeñar un papel regulador importante en el cambio fibromático pulmonar en los pulmones. La regulación descendente de let-7d en fibrosis pulmonar idiopática (IPF) resultó en un aumento de la deposición de colágeno y engrosamiento septal alveolar [119] En un modelo diferente de ratón asmático, se observó un aumento en la expresión de miR-21 en los pulmones [123]. Este informe podría contribuir a la comprensión del mecanismo inflamatorio en la vía aérea a través de la inhibición de IL-12, favoreciendo la respuesta de linfocitos Th2. Un receptor 4 (TLR4) inducido por Th2 induce una alta expresión de miR-126, y el bloqueo selectivo de miR-126 suprimió el fenotipo asmático [124]. Además, la remodelación de la vía aérea es una característica del asma y tiene importantes implicaciones funcionales. Rodríguez et al. han demostrado que miR-155 está relacionada con el desarrollo de infiltración inflamatoria en el pulmón y la remodelación de la vía aérea [122]. Así, algunos estudios presentan una conexión funcional entre la expresión de miRNA y la patogénesis del asma y sugieren que dirigir miRNA en las vías respiratorias puede conducir a tratamientos antiinflamatorios para el asma alérgica. A pesar de la evidencia de modelos experimentales, el perfil de expresión de miRNAs en biopsias de vías respiratorias de pacientes con asma leve antes y después del tratamiento con corticosteroides inhalados y en voluntarios sanos no reveló diferencias en la expresión de miRNAs [135]. Se requieren investigaciones adicionales sobre el papel de los miRNAs relacionados con la patogénesis del asma. Aunque la evidencia básica de la biología de miRNAs sigue proporcionando nuevas ideas, las aplicaciones de la terapia basada en miRNAs para enfermedades pulmonares inflamatorias son menos avanzadas que las del cáncer de pulmón [136]. Una razón de esto podría ser que la heterogeneidad de la enfermedad es causada por los efectos de muchos contaminantes ambientales del aire, incluyendo humo y compuestos orgánicos volátiles. La presencia de varios factores de riesgo complica la comprensión de la patogénesis de enfermedades pulmonares inflamatorias. La comprensión del papel que desempeñan los miRNAs en la modulación de la expresión génica, que conduce a sostener la patogénesis de las enfermedades pulmonares, es importante para el desarrollo de nuevas terapias que se centran en la prevención de la progresión de la enfermedad y el alivio de los síntomas. Dadas las importantes funciones que desempeñan los miRNAs en múltiples vías de carcinogénesis pulmonar, se están dedicando cada vez más esfuerzos a la investigación y desarrollo de terapias basadas en miRNAs, incluyendo la restauración de las funciones de miRNAs supresoras de tumores o la inhibición de miRNAs oncogénicos. El desarrollo de terapias basadas en miRNAs para el cáncer de pulmón está creciendo prósperamente con la ayuda de nuevas tecnologías ARNi. En comparación con las terapias basadas en siRNAs, que ya están en ensayos clínicos, los miRNAs son menos tóxicos y tienen el potencial de Los problemas críticos para el desarrollo de esta terapia son la entrega efectiva a los sitios de destino, la potencia de la terapia y la eliminación de los efectos fuera de la diana [137]. Hay dos estrategias como las aplicaciones terapéuticas de los miRNAs para el cáncer de pulmón [138]. Una estrategia es la terapia de reemplazo de miRNAs, que implica la reintroducción de un miRNA supresor tumoral imitado para restaurar una pérdida de la función. MiRNAs imitan a los duplex de ARN sintéticos diseñados para imitar las funciones endógenas de los miRNAs con modificaciones químicas para la estabilidad y la absorción celular. El concepto de terapia de reemplazo de miRNAs es más ejemplificado por el miRNAs let-7. let-7 es un miRNAs tumor-supresor en cáncer de pulmón no microcítico que se correlaciona inversamente con la expresión La administración intranasal de let-7 imitado en modelos de ratón de cáncer de pulmón redujo significativamente el crecimiento del tumor, lo que sugiere que la terapia de reemplazo de miRNA es realmente prometedora [106, 140, 141]. Otro miRNA que muestra el valor del reemplazo de miRNA es proporcionado por miR-34a [107, 142]. La administración local y/o sistémica de una miR-34a sintética imitada llevó a la acumulación de miR-34a en el tejido tumoral e inhibición del crecimiento del tumor pulmonar. Últimamente, Ling et al. también mostraron que el supresor miR-22 mostró actividad anti-cáncer pulmonar mediante la regulación post-transcripción de ErbB3 [143]. Así, las miRNA terapéuticas imitadas tienen un potencial poderoso atacando genes múltiples relevantes para varias enfermedades. Sin embargo, es necesario prestar atención a la toxicidad potencial en los tejidos normales en condiciones en las que la administración terapéutica de miRNA imita conducirá a una acumulación de miRNAs exógenos en células normales [138]. Aunque las suposiciones están bien fundadas, todavía hay evidencia insuficiente de toxicidad causada por miRNA imitaciones. De hecho, varios estudios in vivo fallaron en revelar efectos secundarios causados por los miRNA imitaciones y sugirió que la entrega de miRNA imitaciones a tejidos normales fue bien tolerada [107, 141]. Será importante investigar los efectos miRNAs imitados en células normales y evaluar cuidadosamente la toxicidad antes de utilizarlos en la práctica clínica. La segunda estrategia se dirige a una ganancia de función y tiene como objetivo inhibir oncomiRs mediante el uso de anti-miRNAs. Las modificaciones químicas, como el grupo 2'-O-metilo y el ácido nucleico bloqueado (LNA), aumentarían la estabilidad del oligo contra las nucleasas [144]. Los oligonucleótidos antisensibles contenidos en estas modificaciones se denominan antagomirs o "LNA-antimiRs" [144, 145]. Son oligonucleótidos con secuencias complementarias al miRNA endógeno e inhiben la función específica del miRNA. Se ha demostrado que un LNA-antimiR contra miR-122 silencia efectivamente miR-122 en primates no humanos [145], y los hallazgos apoyan el potencial de estos compuestos como una nueva clase terapéutica. Además, también se ha reportado que los anti-miR-150 suministrados en el tumor pulmonar xenoinjertos en ratones llevaron a un crecimiento tumoral inhibido En relación con estudios sobre miRNA imitados, estudios con oligonucleótidos antisensibles han mostrado evidencia efectiva con oligonucleótidos desnudos, lo que ilustra el potencial de modificaciones químicas de oligonucleótidos para mejorar su estabilidad, resistencia a la RNASa y propiedades farmacológicas, por lo que la inhibición de la función miRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificados se ha convertido en un enfoque importante y ampliamente utilizado. Datos recientes del primer estudio de fase II en pacientes con infección crónica por VHC tratados con el antimiR-122 modificado por LNA mostraron que este compuesto fue bien tolerado y proporcionó supresión viral continua. Un número creciente de estudios han examinado el potencial terapéutico de los miRNAs. Recientemente, ha surgido la evidencia de roles para miRNAs en la determinación de resistencia a fármacos [147]. En esta situación, la combinación de miRNA imita o antimiR con quimioterapia puede potenciar la eficacia del tratamiento del cáncer en el futuro. Además, los miRNA relacionados con las células madre cancerosas pueden ampliar significativamente el campo de la terapia basada en miRNA y sugerir que los miRNAs pueden ser herramientas potenciales para destruir las células cancerosas asociadas con la resistencia a la terapia, recurrencia y metástasis [108, 148]. Por lo tanto, el principal desafío es el suministro exitoso y las modificaciones químicas de los miRNAs terapéuticos al tejido objetivo sin dañar los tejidos normales. Los enfoques basados en ARNi proporcionan una modalidad terapéutica prometedora para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. Uno de los mayores desafíos en la terapia basada en ARNi sigue siendo el método de entrega de los siRNAs terapéuticos y miRNAs a las células objetivo. Las aplicaciones de parto pulmonar son muy atractivas, ya que tienden a ser no invasivas, son localmente restringidas y pueden ser administradas por el paciente. Una intervención terapéutica realista, como la aerosolización, puede mejorar la administración de medicamentos en el lugar de acción y disminuir la exposición sistémica del paciente a la terapia, reduciendo así los efectos fuera de la diana. El avance de la entrega de siRNA pulmonar a la clínica ilustra que la terapia basada en ARNi ocupa un lugar central en el tratamiento futuro de las enfermedades pulmonares. Por otro lado, los miRNAs tienen la oportunidad de dirigir genes múltiples de una manera refinada, y la terapia basada en miRNA proporcionará un atractivo enfoque antitumoral y antiinflamatorio para diversas enfermedades pulmonares. En particular, la terapia antimiRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificado se ha convertido en una terapia potencial para enfermedades pulmonares porque los oligonucleótidos El aumento de la evidencia ha indicado que los miRNA cumplen funciones causales en una variedad de enfermedades pulmonares y han impulsado investigaciones sobre su potencial como dianas terapéuticas. Para el desarrollo futuro se requieren una mayor comprensión de los mecanismos detallados de la terapia basada en ARNi y la investigación de métodos de parto más eficaces. Estos nuevos enfoques podrían abrir nuevas vías para diversas enfermedades pulmonares y mejorar el resultado clínico de los pacientes.
|
¿Por qué la mucosa nasal es útil en la entrega de pequeñas moléculas en el cuerpo?
| false
| 1,615
|
{
"text": [
"the surface area can result in rapid absorption of the medication into the blood"
],
"answer_start": [
3446
]
}
|
la superficie puede dar lugar a una rápida absorción del medicamento en la sangre
|
641
|
Las plataformas terapéuticas de RNAi para las enfermedades pulmonareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816685/Fujita, Yu; Takeshita, Fumitaka; Kuwano, Kazuyoshi; Ochiya, Takahiro2013-02-06DOI:10.3390/ph6020223Licencia:cc-byAbstract: La interferencia del ARN (ARNi) se está convirtiendo rápidamente en un método importante para analizar las funciones genéticas en muchos eucariotas y promete el desarrollo de silenciamiento genético terapéutico. La inducción de RNAi se basa en los pequeños ARN silenciadores, que afectan a la degradación específica del ARN mensajero (ARNm). Los estudios de descubrimiento de fármacos y los tratamientos novedosos de los siRNAs están actualmente dirigidos a una amplia gama de enfermedades, incluyendo varias infecciones virales y cánceres. Las enfermedades pulmonares en general son blancos atractivos para las terapias de siRNAs debido a su letalidad y prevalencia. Además, el pulmón es accesible anatómicamente a los agentes terapéuticos a través de la vía intrapulmonar. Recientemente, la evidencia creciente indica que los miRNAs desempeñan un papel importante en las anomalías pulmonares, como la inflamación y la oncogénesis. Por lo tanto, los miRNAs están siendo dirigidos con fines terapéuticos. En esta revisión, presentamos estrategias para el parto de ARNi y discutimos el estado actual de la técnica RNAi basada en el arte para diversas enfermedades pulmonares. Texto: cirugía tradicional, Bivas-Benita et al. reportaron que no se produjo mortalidad como resultado del uso de Las aplicaciones endotraqueales están siendo utilizadas actualmente por muchos profesionales en el campo pulmonar [22, 34] ; esto es útil para estudiar la administración de fármacos pulmonares en ratones. Sin embargo, el enfoque es más complejo en humanos porque se utiliza una vía artificial para la entrega de medicamentos en los pulmones. Por lo tanto, el método se está utilizando en modelos animales para probar y evaluar su fiabilidad para posibles aplicaciones clínicas. Ruta intraqueal: bajo anestesia, la tráquea se expone quirúrgicamente, y se inserta un tubo o aguja a través de una incisión hecha entre los anillos traqueales. Complicaciones, tales como lesiones vasculares y fugas de aire, son posibles debido a la traqueotomía. b) Ruta endotraqueal: los siRNAs se rocian directamente desde la boca a los pulmones utilizando un aerolizador MicroSprayer ® (Penn-Century, Filadelfia, PA Es importante mantener una visión clara de la tráquea durante el procedimiento. El parto intranasal es otro método común de aplicación de fármacos pulmonares en estudios en animales. En muchos estudios, se ha demostrado éxito in vivo en la entrega de siRNAs a los pulmones intranasal [22, 35, 36 ]. Una configuración experimental de la entrega intranasal por pulverización o gotita es simple e indolora para el animal. Aunque el éxito en la entrega de siRNAs intranasal en roedores no puede ser completamente extrapolado al uso humano debido a las diferencias significativas en anatomía pulmonar [37], este enfoque tiene potencial para la aplicación clínica de siRNAs. Ensayos clínicos de fase II se han iniciado para el tratamiento de la infección por el virus sincitial respiratorio (RSV), haciendo uso de la aplicación intranasal de moléculas de siRNAs desnudas modificadas químicamente que se dirigen a los productos La entrada intranasal se ha utilizado durante mucho tiempo para administrar moléculas pequeñas, como proteínas, para el parto sistémico. Debido a que la mucosa nasal está altamente vascularizada, la entrega de un epitelio delgado de medicación a través de la superficie puede dar lugar a una rápida absorción del medicamento en la sangre. Por lo tanto, los siRNA administrados intranasalmente pueden depositarse en la nariz, y algunos de ellos pueden no poder llegar al tracto respiratorio inferior. De hecho, se ha informado que la aplicación intranasal de siRNAs no formulados dio lugar a una menor eficiencia de entrega y distribución pulmonar homogénea que la alcanzada con la aplicación intratraqueal [31]. El método intranasal es adecuado para algunas enfermedades pulmonares, como la infección respiratoria superior por VSR, y también tiene potencial para el parto sistémico en lugar de la entrega pulmonar de siRNAs. Por lo tanto, es importante considerar la vía de administración El uso de aerosoles para administrar medicamentos a los pulmones tiene un largo historial. La administración por inhalación es un método popular y no invasivo de administrar agentes a los pulmones. Hay varios dispositivos de inhalación disponibles para la entrega de medicamentos a los pulmones. Los inhaladores de dosis medidas (IDM) y los inhaladores de polvo seco (IDP) son los modos más comunes de administrar inhalación. Los inhaladores de dosis medidas son los inhaladores más utilizados para varias enfermedades pulmonares, como el asma, la bronquitis y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y un espaciador es un dispositivo externo que se une a una IDM para permitir una mejor administración de medicamentos mediante una mayor coordinación de la activación y la inhalación. Para la mayoría de los IDM, el propelente es uno o más gases llamados clorofluorocarbonos (CFC). Aunque los CFC en los medicamentos son seguros para que los pacientes inhalen, son perjudiciales para el medio ambiente. Por lo tanto, el desarrollo ulterior de los siRNA inhalables puede no ser la mejor manera de avanzar. Los DPI son dispositivos que entregan medicamentos a los pulmones en forma de polvo seco. El uso de los DPI ya ha demostrado ser prometedor para la entrega in vivo de macromoléculas terapéuticas como la insulina [39] y la heparina de bajo peso molecular [40] ; por lo tanto, podría ser un mejor dispositivo para la entrega de siRNAs a los pulmones. Las ventajas de los DPI son una mayor estabilidad y esterilidad de las biomoléculas sobre aerosoles líquidos y la formación libre de propelentes. Aunque los medicamentos se envían comúnmente a los pulmones por inhalación, la mayoría de los estudios in vivo que utilizan siRNAs se han basado en la entrega intratraqueal También se necesita un portador adecuado para proteger los ácidos nucleicos de la degradación debido a la fuerza de corte y al aumento de la temperatura durante el proceso de secado. Se ha demostrado el uso del secado por pulverización como técnica para la ingeniería de formulaciones en polvo seco de nanopartículas de siRNA, que podrían permitir la entrega local de siRNA biológicamente activo directamente al tejido pulmonar [24, 25]. En el futuro, la técnica es deseable para estimar el estudio in vivo sobre terapia de siRNA para inhalación. A largo plazo, anticipamos que habrá dispositivos más sofisticados para el uso clínico y que los que se están desarrollando serán más adecuados. Hay dos barreras principales para la entrega eficiente de siRNA pulmonar a las células del pulmón. La primera es la anatomía compleja y ramificada de los pulmones y barreras biomecánicas, como la capa de muco que cubre las células de las vías respiratorias [41, 42 La vía aérea consiste en bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y sacos alveolares. Todas estas estructuras contienen alvéolos, los diminutos sacos de aire en los que se produce el intercambio de gas. Generalmente se reconoce que el factor crítico para la entrega eficiente de siRNA depende de las propiedades de las partículas del fármaco ARNi en términos de tamaño, carga, forma, velocidad y densidad. Para la entrega eficiente de siRNA pulmonar, las partículas deben depositarse en el tracto respiratorio inferior. La deposición en la vía aérea se ve afectada por el tamaño de las partículas y la función pulmonar del paciente. Se encuentra que el tamaño de las partículas entre 1-5 μm es el más apropiado para la deposición en el tracto respiratorio inferior [23]. Además, la presencia de proteínas mucos y surfactantes, las acciones de aclaramiento mucociliar y la fagocitosis por Por lo tanto, los sistemas de parto generalmente requieren vectores de parto, y estos vectores necesitan ser diseñados con el fin de maximizar la deposición de siRNA en el área enferma del tracto respiratorio. Además, las barreras extracelulares al parto de siRNA también dependen de características fisiológicas del tracto respiratorio, que pueden cambiar con la enfermedad y características del paciente. En el estadio activo de la enfermedad pulmonar, las condiciones fisiológicas de las vías respiratorias podrían cambiar y tener un impacto significativo en la eficiencia del sistema de parto pulmonar. Durante la infección, inflamación y reacción alérgica, hay un aumento en la secreción de mucosidad junto con el aclaramiento mucociliar dañado [43]. Además, el asma y la EPOC son ambas condiciones inflamatorias crónicas del pulmón asociadas con "remodelación" estructural que no es apropiada para el mantenimiento de la función pulmonar normal [44]. Figura 2. Barreras extracelulares al parto de siRNA pulmonar. La característica anatómica del tracto respiratorio es su alto grado de ramificación. El moco alinea el epitelio respiratorio desde la cavidad nasal hasta los bronquios terminales. Las partículas depositadas en las células epiteliales ciliadas son rápidamente despejadas por las acciones de aclaramiento mucociliar. El muco y el aclaramiento mucociliar de las partículas atrapadas por mucosidad es un mecanismo de defensa pulmonar como barrera fisiológica. En las células alveolar, clara y alveolar tipo II se secretan en la superficie del epitelio alveolar, formando una capa delgada de surfactantes pulmonares. Los surfactantes actúan como barrera principal para el parto de siRNA porque reducen la eficiencia de la transfección. Además, los macrófagos ubicados en los alveolos absorbe Las partículas recogidas en los macrófagos se degradan posteriormente dentro de las células, los cuales presentan barreras importantes para el parto pulmonar dirigido; el segundo es el membrance de las células de las vías respiratorias y sus barreras intracelulares (Figura 3 ). Para el silenciamiento eficiente de los genes en los pulmones, los siRNAs deben ser entregados a su sitio de acción, ser estables, entrar en las células diana y estar presentes en el citoplasma a una concentración suficiente; una vez que los siRNAs alcanzan las células diana, deben ser transportados al citoplasma y llevados por Argonaute (Ago)2/complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que degrada los mRNAs y, posteriormente, suprime la expresión génica secuencia-específica; para que ocurra una endocitosis eficiente, las partículas deben tener un tamaño inferior a 150 nm. Las propiedades fisicoquímicas de los siRNA también juegan un papel significativo en el cruce de la membrana biológica. A pesar de su pequeño tamaño, la carga negativa y la degradabilidad química de las moléculas de siRNA les impiden cruzar fácilmente las membranas biológicas. Por lo tanto, los enfoques eficientes de siRNA necesitan superar esta limitación facilitando la captación celular. Una de las principales funciones de un vector de entrega es facilitar la captación celular de siRNA [46]. La complejación electrostática de moléculas de siRNA con lípidos y polímeros catiónicos ayuda a enmascarar su carga negativa neta. El complejo portador de siRNA con carga positiva interactúa con proteoglicanos aniónicos en la membrana celular, forma una vesícula endocítica, y entra en las células por endocitosis [47]. Después de la internalización celular, el complejo portador de siRNA en vesículas endocíticas es transportado a lo largo de microtúbulos a lisosomas que son colocalizados con el centro organizador de microtúbulos. Para evitar la degradación lisosómica, los siRNAs deben escapar del endosoma al citoplasma, donde pueden asociarse con la maquinaria ARNi. El escape endosomal es una barrera importante para la entrega eficiente de siRNA [48, 49]. El endosomal atrapamiento y la degradación lisosómica del siRNA y los portadores contribuyen a la baja eficiencia de transfección y es una dificultad importante para los vectores de entrega. Un agente de entrega ideal debe proteger los siRNAs de la degradación enzimática, facilitar la absorción celular, y promover la fuga endosomal dentro de las células con toxicidad insignificante. Se han reportado múltiples enfoques para la entrega de siRNAs, que van desde la administración directa relativamente simple de siRNAs con forma salina hasta enfoques de nanopartículas basadas en lípidos y polímeros y enfoques de conjugación y complejación de siRNAs [50]. La carga negativa y la degradabilidad química de los siRNAs bajo condiciones fisiológicamente relevantes hacen que su entrega sea un desafío importante. En consecuencia, la entrega de siRNAs generalmente requiere un vector o portadores para su transfección en las células diana. En general, se están evaluando vectores virales y no virales para la entrega de siRNAs a las células pulmonares. Algunos vectores virales, como retrovirus y adenovirus, han sido demostrados para mediar el silenciamiento genético en un modelo pulmonar in vitro [51] e inducir RNAi en una gama de tejidos animales [52]. Demostró que el siRNA mediado por lentivirus fue utilizado específicamente para derribar la expresión de la proteína nuclear 1 (NUPR1) in vivo, lo que resultó en un crecimiento tumoral inhibido [53]. Sin embargo, el parto basado en virus tiene varias desventajas. La respuesta inmune a los virus no sólo impide la entrega de genes sino que también tiene el potencial de causar complicaciones graves [54]. Casos recientes bien documentados, como la muerte de Jesse Gelsinger debido a complicaciones relacionadas con un vector de distribución adenoviral, destacan este problema [55]. Además, algunos vectores virales pueden insertar su genoma en posiciones aleatorias en el cromosoma huésped, lo que finalmente restringe la función génica [56].. Barreras intracelulares para la entrega de siRNA pulmonar. Las barreras a la internalización celular dependen de las propiedades superficiales del siRNA y los portadores (por ejemplo Después de que los siRNAs sean llevados exitosamente a las células diana por medio de endocitosis, las principales barreras para entregar siRNAs a su sitio de acción son la atrapación endosomal y la degradación lisosómica del siRNAs y los portadores. Para dirigir el silenciamiento del gen diana, los siRNAs necesitan escapar del endosoma hacia el citoplasma, donde se asocian con el complejo silenciador inducido por Ago2/ARN (RISC) para dirigir la división de mRNAs con sitios de unión complementarios. Como alternativa a los vectores virales, los vectores no virales, incluyendo vectores basados en lípidos y polímeros, generalmente se han utilizado para la entrega de siRNAs a los pulmones debido a su toxicidad reducida [57]. Los vectores de entrega basados en lípidos se utilizan con éxito para producir siRNA in vitro e in vivo [58]. Los lípidos catiónicos están compuestos de cabeza cargada positivamente, un enlace e hidrofóbico. En general, los complejos basados en lípidos son fáciles de formular y se logra una buena eficacia de transfección debido a la interacción con la membrana celular cargada negativa. Muchos agentes de transfección de siRNA comerciales son sistemas de administración basados en lípidos, algunos de los cuales también se emplean para el parto pulmonar-DharmFECT [30], Oligofectamina [59], Lipofectamina [60] y TransIT-TKO [35]. Del mismo modo, los polímeros catiónicos también se han evaluado para la entrega de siRNA a las células pulmonares. Por otro lado, los vectores basados en lípidos también pueden inducir toxicidad y activación inespecífica de las respuestas inflamatorias de citocina e interferón [62, 63]. Aunque los vectores basados en polímero provocan una respuesta inmune relativamente menos fuerte que los vectores basados en lípidos, la administración efectiva de siRNA a un área local en enfermedades pulmonares requiere más atención al desarrollo de vectores de entrega no tóxicos. Un punto importante para la inhibición de la expresión génica mediada por siRNA es si los efectos observados son específicos y no debidos a efectos fuera de la meta y no están libres de respuestas potenciales de interferón [64, 65]. Curiosamente, algunos estudios han demostrado que fue posible administrar "siRNA desnuda" a ratones y regular un objetivo endógeno o exógeno sin inducir una respuesta de interferón [66]. Los siRNAs desnudos son degradados por las endonucleasas séricas y generalmente son eliminados por filtración glomerular, resultando en una corta semivida plasmática de < 10 min. Por lo tanto, algunos estudios de la entrega sistémica de siRNAs desnudos no han logrado reducir la regulación del gen objetivo [67, 68]. En contraste, también ha habido algunos éxitos en la entrega local de siRNAs desnudos a los pulmones [15, 16, 20, 31]. Algunos de ellos reportaron que el uso de vectores de distribución no mostró diferencia significativa en la eficiencia silenciadora de genes en comparación con la de los siRNAs desnudos [16, 35]. De hecho, en un ensayo clínico, se ha utilizado la entrega de siRNAs desnudos para el tratamiento de RSV [17, 38]. Esta evidencia exitosa puede ser debido a que los siRNAs desnudos para aplicaciones clínicas son altamente modificados químicamente para prevenir la degradación inducida por nucleasa y presumiblemente minimizar los efectos estimuladores inmunes. Aunque no está claro cómo los siRNAs desnudos cruzan la membrana celular, obtienen acceso al citoplasma y permanecen intactos para realizar su acción biológica, tanto los ensayos en animales como en humanos se han llevado a cabo exitosamente, mostrando la eficacia de los siRNAs desnudos (ALN-RSV01) que fueron administrados intranasalmente. Esta explicación no ha sido confirmada, pero el daño fisiológico de las células epiteliales respiratorias causadas por infección viral puede posiblemente haber influido en el misterio. El cambio activo en la membrana celular epitelial de la vía aérea causada por enfermedad infecciosa podría afectar la internalización celular. Sin embargo, la ventaja de los siRNA desnudos sobre los vectores de parto en el tratamiento de enfermedades pulmonares es controvertida [69, 70]. Se requieren más investigaciones in vivo sobre los siRNA desnudos y los vectores no virales. La enfermedad pulmonar es una de las principales causas de muerte, y la disminución de la calidad de vida es responsable del sufrimiento de muchos pacientes. Varias enfermedades pulmonares hacen la vida extremadamente difícil para los pacientes, y los casos graves de estas enfermedades pulmonares pueden resultar en la muerte. Las altas tasas de muerte asociadas con el cáncer de pulmón se deben en parte al hecho de que es lamentablemente difícil de curar. Sobre todo, la EPOC es la cuarta causa de muerte en la mayoría de los países industrializados y se prevé que se convierta en tercera para 2020 [71]. Por lo tanto, se necesita una acción decisiva para frenar el aumento de la salud y la carga económica que esto representa. Las enfermedades pulmonares crónicas La aprobación de corticosteroides inhalados fue pionera en una nueva generación de terapia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, siendo la primera vez que se disponía de un producto antiinflamatorio para reducir la inflamación pulmonar característica en las vías respiratorias y la obstrucción asociada. Los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica. Sin embargo, se utilizan con limitaciones en la EPOC y asma de moderada a grave. Asimismo, el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares refractarias también depende de la terapia sistémica con corticosteroides. Muchos de estos pacientes también sufrieron diversos efectos secundarios del uso sistémico de corticosteroides, como aumento de peso e hiperglucemia no controlada. El tratamiento de la enfermedad pulmonar utilizando una orientación celular específica, así como técnicas RNAi, representan una estrategia novedosa y podrían proporcionar nuevas oportunidades en nanomedicina. Las aplicaciones pulmonares de siRNA in vivo son frecuentemente estudiadas y a menudo resultan en ensayos clínicos [57, 72]. Desde el descubrimiento de ARNi, el potencial terapéutico de los siRNAs ha sido rápidamente reconocido. En 2004, el primer ensayo clínico humano de terapia basada en ARNi se inició para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad con un siRNA dirigido al receptor de VEGF 1 entregado intravítreamente [73]. Se han realizado muchos estudios en los últimos años que involucran la entrega de siRNAs a los pulmones para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. La entrega a los pulmones será más importante para mover la tecnología de siRNAs a la clínica. Se están evaluando varias terapias basadas en siRNAs en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes condiciones, incluyendo enfermedades pulmonares como asma e infección por VSR. La Tabla 1 es un resumen de ensayos clínicos de terapias basadas en siRNAs [74]. El siRNA muestra potencial para el tratamiento de varias infecciones virales pulmonares, y se ha reportado que los tratamientos basados en el siRNA también pueden ser utilizados en el tratamiento de la gripe [13], el virus de la parainfluenza [35], el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) [14], y el VRS [35]. Sobre todo, el VRS es el objetivo terapéutico más prometedor de los siRNAs. El VRS es una causa común de infecciones respiratorias graves en lactantes y niños. También produce morbilidad y mortalidad significativas en poblaciones adultas inmunocomprometidas o ancianas [75]. No se dispone de una vacuna contra el VRS, y la única terapia antiviral aprobada para el VRS es indeseable para los pacientes pediátricos debido a su potencial teratogenicidad y eficacia limitada. El tratamiento basado en ARNi ha mostrado efectos prometedores en modelos murinos de infección por VRS [35]. El siRNA, ALN-RSV01, está dirigido contra el ARNm que codifica la proteína N del VRS que exhibe actividad anti-VRS específica in vitro e in vivo. Se entrega sin un vector de parto como aerosol nasal y se dirige al tracto respiratorio superior en lugar del área pulmonar inferior. ALN-RSV01 ha sido sometido a estudios completos de fase I intranasal e inhalación en adultos sanos y se ha encontrado que es generalmente bien tolerado [38]. Además, ALN-RSV01 ha sido evaluado en un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en pacientes trasplantados de pulmón con infección del tracto respiratorio RSV [76]. La administración de ALN-RSV01 a pacientes de trasplante de pulmón infectados por VRS fue segura y bien tolerada y asociada con una Basándose en estos resultados, se ha iniciado un ensayo multinacional más amplio, aleatorizado y doble ciego de fase IIb de ALN-RSV01 en pacientes con trasplante de pulmón para confirmar y extender estos hallazgos. El cáncer es un objetivo principal de la terapia basada en ARNi, ya que los oncogenes, los genes supresores de tumores mutados y varios otros genes que contribuyen a la progresión del tumor son objetivos potencialmente importantes para el silenciamiento de genes por ARNi. El cáncer de pulmón es uno de los tumores más frecuentes en todo el mundo con respecto a las tasas de incidencia y mortalidad. Los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican comúnmente en un estadio avanzado de la enfermedad y tienen opciones terapéuticas limitadas. La principal ventaja de la terapia ARNi en el cáncer podría ser la focalización simultánea de genes múltiples pertenecientes a diferentes vías celulares que participan en la progresión del tumor. La inhibición simultánea de varios genes también minimizaría el riesgo de resistencia a fármacos que normalmente se encuentran con terapias basadas en pequeñas moléculas, que involucran siRNAs y miRNAs. Ya ha habido mejoras significativas en los siRNAs para el tratamiento primario o metastásico del cáncer de pulmón al dirigirse a oncogenes como Akt1 [9], tumor de Wilms 1 (WT1) [12], genes sobreexpresados como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) [77], NUPR1 [53] y EZH2 [78]. Algunos de estos estudios han demostrado con éxito la eficacia de la terapia basada en ARNi mediante la administración intrapulmonar de siRNAs Aunque se deben diseñar estrategias para minimizar los efectos inmunoestimuladores fuera de objetivo y no específicos, estos datos sugieren que el silenciamiento del gen diana con siRNAs es una estrategia atractiva para la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón primario y metastásico. Actualmente hay algunos ensayos clínicos en curso que estiman la seguridad y eficacia de los fármacos basados en siRNAs para el tratamiento del cáncer. Atu027, un siRNA-lipoplex dirigido contra la proteína cinasa N3 (PKN3), previno la metástasis pulmonar en un ensayo de fase I de varios modelos de cáncer [79]. PKN3 es un efector aguas abajo de la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), que regula diversas respuestas celulares, incluyendo desarrollo, crecimiento y supervivencia [81]. Recientemente, PKN3 también ha sido considerado como una diana terapéutica adecuada para modular la angiogénesis tumoral debido a que la pérdida de análisis de función con Atu027 en células endoteliales primarias cultivadas mostró un papel esencial de PKN3 para la formación y migración de tubos endoteliales [79]. Atu027 puede ser considerado como un potencial siRNA para prevenir metástasis pulmonares y podría ser adecuado para prevenir metástasis hematógenas combinadas con terapia convencional del cáncer. La enfermedad pulmonar inflamatoria, también llamada EPOC, incluye una amplia gama de dolencias pulmonares. Estas enfermedades relacionadas incluyen asma, fibrosis pulmonar y bronquitis crónica. Están influenciadas por una combinación de componentes ambientales, genéticos y epigenéticos [82]. La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. La EPOC se asocia principalmente al tabaquismo, y estudios recientes que investigan la fisiopatología del enfisema han demostrado que el humo del cigarrillo puede causar que las células entren en la senescencia celular. Fumar puede causar senescencia a las células debido al daño del ADN a través del aumento del recambio celular, lo que a su vez conduce al acortamiento acelerado del telómero [84]. Últimamente, muchos estudios han investigado el papel de la senescencia celular en el desarrollo y la progresión de la EPOC [85]. Aunque varias clases de medicamentos, incluyendo corticosteroides inhalados, se utilizan para el tratamiento de la EPOC, ninguno de estos medicamentos ha demostrado mejorar significativamente la función pulmonar a largo plazo durante la progresión de la enfermedad. Muchas personas están desarrollando EPOC, y la causa de esta afección es complicada y no se comprende a fondo.Un factor clave es la susceptibilidad genética.Algunos estudios han mostrado una gran contribución genética a la variabilidad de la función pulmonar y EPOC [86, 87].Los polimorfismos en genes múltiples se han reportado asociados con EPOC [87], tales como factor de transcripción [por ejemplo factor nuclear-kappa B (NFoB)] [88], matriz extracelular (por ejemplo, matriz metaloproteinasa-12 (MMP-12)) [89, 90], citocinas [por ejemplo factor de necrosis tumoral (TNF)-α] [91], quimioquinas [por ejemplo. la interleucina (IL)-8, el receptor IL-8 y el receptor de quimiocina (CCR)1 [92, 93], y la apoptosis (por ejemplo, caspasa-3 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) [94, 95]. Muchos de ellos se han identificado como posibles blancos de la intervención terapéutica utilizando inhibidores de moléculas o antagonistas. Aunque varios tratamientos nuevos que se dirigen al proceso inflamatorio se encuentran ahora en desarrollo clínico, como inhibidores del TNF-α e inhibidores del complejo I-kappaB cinasa 2 (IKK2) [96, 97], los ensayos clínicos con siRNA nunca se han realizado en la EPOC. El retraso en el desarrollo de fármacos para la EPOC podría deberse a la aparición relativamente reciente de investigaciones que abordan la base molecular de la EPOC. Además, se necesitan más investigaciones para entender los mecanismos moleculares esenciales sobre la patogénesis de la EPOC y desarrollar técnicas de monitoreo para apoyar el desarrollo de terapias ARNi. Actualmente, no hay tratamientos disponibles que reduzcan la progresión de la EPOC o supriman la inflamación en las vías aéreas pequeñas y el parénquima pulmonar. El enfoque basado en los ARNi para las moléculas clave también tiene implicaciones potenciales para el tratamiento de la EPOC. El asma es también una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas caracterizada por síntomas variables y recurrentes y obstrucción reversible del flujo de aire. La Organización Mundial de la Salud estima que actualmente están afectadas 300 millones de personas y que, para el año 2025, otros 100 millones serán afectados por la enfermedad [98]. Los corticosteroides inhalados son muy eficaces en asma leve porque mejoran los síntomas y disminuyen las exacerbaciones. Aunque los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica para las enfermedades pulmonares inflamatorias, su uso no siempre es completamente efectivo y está asociado con efectos secundarios. Debido a estas limitaciones, está claro que hay una necesidad de nuevos tipos de medicamentos que pueden tratar y mejorar el pronóstico de asma moderada a grave. Se han identificado muchos genes diana que participan en la patogénesis del asma. Los objetivos más prometedores incluyen la codificación de genes para citoquinas (IL-4, IL5, IL-13), receptores de citoquinas y quimioquinas (IL-4 y CCR3), y tirosina quinasas [tirosina quinasa batida (Syk) y nuevas tirosina quinasa (Lyn) relacionadas con LCK/YES)], así como para factores de transcripción [transductores de señales y activadores de transcripción 1 (STAT1), STAT6, GATA3 y NF Actualmente, en un ensayo clínico para el asma, Excellair TM (ZaBeCor, Bala Cynwyd, PA, EE.UU.), se está utilizando un siRNA que se dirige a Syk. La cinasa está involucrada en la señalización de un receptor de células B y es un regulador clave de cascadas de señalización aguas abajo que en última instancia conducen a la activación de varios factores de transcripción proinflamatorios. Se ha reportado que los oligonucleótidos antisensibles administrados por aerosol fueron potentes para disminuir la expresión de Syk, liberación mediadora de macrófagos alveolares e inflamación pulmonar dependiente de Syk [102]. Además, se ha demostrado la inhibición de mediadores inflamatorios en un estudio utilizando siRNA dirigido a Syk en células epiteliales de vía aérea [103]. Algunos de los tratamientos actuales para el asma y otras condiciones inflamatorias, tales como inhibidores del TNF-α o inhibidores del leucotrieno, inhiben sólo uno de los mediadores de la inflamación. En contraste, el siRNA dirigido Syk busca inhibir un paso inicial de señalización de la inflamación y, por lo tanto, evitar la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. En general, el progreso reciente de los siRNAs a los pulmones también ha mejorado la viabilidad terapéutica de los ARNi para enfermedades pulmonares inflamatorias. El progreso rápido pondrá los tratamientos basados en el siRNA en una vía rápida a la clínica. MiRNAs son pequeños ARNs no codificantes endógenos que regulan la expresión génica reprimiendo la traducción o promoviendo la degradación de su mRNA objetivo. MiRNAs regulan la expresión génica mediante la unión a la 3′ región no traducida (UTR) de En el genoma humano, se estima que las transcripciones de aproximadamente el 60% de todos los ARNm están dirigidas por los miRNAs [104]. De acuerdo con su función, los miRNAs desempeñan un papel importante en los procesos celulares como desarrollo, proliferación y apoptosis de patologías pulmonares [105]. Se ha demostrado que un número creciente de miRNAs están involucrados en diferentes enfermedades pulmonares. Esta evidencia hace de los miRNAs una tecnología prometedora para el desarrollo terapéutico actual y futuro. Discutimos el papel de algunos miRNAs en diversas enfermedades pulmonares, así como el posible futuro de estos descubrimientos en aplicaciones clínicas.La Tabla 2 muestra el resumen de los miRNAs en el desarrollo terapéutico.En este punto, una terapia basada en miRNAs ya ha entrado en un ensayo clínico de fase II.Existe evidencia de que la regulación ascendente o descendente de los miRNAs es Muchos estudios se han centrado en el papel de los miRNAs en las enfermedades pulmonares inflamatorias, como la EPOC [116, 117], la fibrosis pulmonar [118] [118] [119] [129] y el asma [122] [123] [123] [125] [125] (Tabla 3). [130] [117, 129] La patogénesis de la EPOC se atribuye no sólo a la inflamación crónica en las vías respiratorias sino también a la inflamación sistémica [131]. El tabaquismo es el principal factor de riesgo para el desarrollo de la EPOC. Se ha demostrado que el tabaquismo causa cambios biológicos en la expresión génica de los pulmones [132], y hay algunos informes sobre los miRNAs relacionados con el tabaquismo [117, 129, 130]. Sin embargo, hay pocos informes que se centran en los miRNAs relacionados con la patogénesis de esta enfermedad con componentes inflamatorios sistémico El estudio reciente sobre fibroblastos pulmonares de pacientes con EPOC presenta menos expresión de miR-146a después de la estimulación con citocinas proinflamatorias en comparación con sujetos no EPOC con historias de tabaquismo similares [127]. La regulación descendente de miR-146a resultó en una vida media prolongada de ciclooxigenasa-2 del ARNm, aumentando así la prostaglandina E2 en fibroblastos de sujetos con EPOC. Además, Ezzie et al. investigaron la diferencia de perfiles de miRNA expresados en los pulmones de fumadores con y sin EPOC. Concluyeron que miR-223 y miR-1274a fueron los miRNA más afectados en sujetos con EPOC [126]. Sin embargo, la EPOC es un trastorno complejo, multicomponente y heterogéneo con una serie de diferentes procesos patológicos y subgrupos con sus propias características Se necesita una mejor comprensión de la complejidad de la enfermedad y de la potencial relevancia clínica de los miRNA identificados. La fibrosis pulmonar puede ser causada por una irritación identificable a los pulmones, pero en muchos casos se desconoce la causa, y las posibilidades terapéuticas son limitadas. El tabaquismo es uno de los factores de riesgo más reconocidos para el desarrollo de fibrosis pulmonar. Este trastorno se acompaña principalmente de una mayor expresión del mediador fibrótico clave que transforma el factor de crecimiento β (TGF-β) y otras citoquinas producidas en la lesión de fibrosis activa [128]. Recientemente, se informó que los miRNAs pueden desempeñar un papel regulador importante en el cambio fibromático pulmonar en los pulmones. La regulación descendente de let-7d en fibrosis pulmonar idiopática (IPF) resultó en un aumento de la deposición de colágeno y engrosamiento septal alveolar [119] En un modelo diferente de ratón asmático, se observó un aumento en la expresión de miR-21 en los pulmones [123]. Este informe podría contribuir a la comprensión del mecanismo inflamatorio en la vía aérea a través de la inhibición de IL-12, favoreciendo la respuesta de linfocitos Th2. Un receptor 4 (TLR4) inducido por Th2 induce una alta expresión de miR-126, y el bloqueo selectivo de miR-126 suprimió el fenotipo asmático [124]. Además, la remodelación de la vía aérea es una característica del asma y tiene importantes implicaciones funcionales. Rodríguez et al. han demostrado que miR-155 está relacionada con el desarrollo de infiltración inflamatoria en el pulmón y la remodelación de la vía aérea [122]. Así, algunos estudios presentan una conexión funcional entre la expresión de miRNA y la patogénesis del asma y sugieren que dirigir miRNA en las vías respiratorias puede conducir a tratamientos antiinflamatorios para el asma alérgica. A pesar de la evidencia de modelos experimentales, el perfil de expresión de miRNAs en biopsias de vías respiratorias de pacientes con asma leve antes y después del tratamiento con corticosteroides inhalados y en voluntarios sanos no reveló diferencias en la expresión de miRNAs [135]. Se requieren investigaciones adicionales sobre el papel de los miRNAs relacionados con la patogénesis del asma. Aunque la evidencia básica de la biología de miRNAs sigue proporcionando nuevas ideas, las aplicaciones de la terapia basada en miRNAs para enfermedades pulmonares inflamatorias son menos avanzadas que las del cáncer de pulmón [136]. Una razón de esto podría ser que la heterogeneidad de la enfermedad es causada por los efectos de muchos contaminantes ambientales del aire, incluyendo humo y compuestos orgánicos volátiles. La presencia de varios factores de riesgo complica la comprensión de la patogénesis de enfermedades pulmonares inflamatorias. La comprensión del papel que desempeñan los miRNAs en la modulación de la expresión génica, que conduce a sostener la patogénesis de las enfermedades pulmonares, es importante para el desarrollo de nuevas terapias que se centran en la prevención de la progresión de la enfermedad y el alivio de los síntomas. Dadas las importantes funciones que desempeñan los miRNAs en múltiples vías de carcinogénesis pulmonar, se están dedicando cada vez más esfuerzos a la investigación y desarrollo de terapias basadas en miRNAs, incluyendo la restauración de las funciones de miRNAs supresoras de tumores o la inhibición de miRNAs oncogénicos. El desarrollo de terapias basadas en miRNAs para el cáncer de pulmón está creciendo prósperamente con la ayuda de nuevas tecnologías ARNi. En comparación con las terapias basadas en siRNAs, que ya están en ensayos clínicos, los miRNAs son menos tóxicos y tienen el potencial de Los problemas críticos para el desarrollo de esta terapia son la entrega efectiva a los sitios de destino, la potencia de la terapia y la eliminación de los efectos fuera de la diana [137]. Hay dos estrategias como las aplicaciones terapéuticas de los miRNAs para el cáncer de pulmón [138]. Una estrategia es la terapia de reemplazo de miRNAs, que implica la reintroducción de un miRNA supresor tumoral imitado para restaurar una pérdida de la función. MiRNAs imitan a los duplex de ARN sintéticos diseñados para imitar las funciones endógenas de los miRNAs con modificaciones químicas para la estabilidad y la absorción celular. El concepto de terapia de reemplazo de miRNAs es más ejemplificado por el miRNAs let-7. let-7 es un miRNAs tumor-supresor en cáncer de pulmón no microcítico que se correlaciona inversamente con la expresión La administración intranasal de let-7 imitado en modelos de ratón de cáncer de pulmón redujo significativamente el crecimiento del tumor, lo que sugiere que la terapia de reemplazo de miRNA es realmente prometedora [106, 140, 141]. Otro miRNA que muestra el valor del reemplazo de miRNA es proporcionado por miR-34a [107, 142]. La administración local y/o sistémica de una miR-34a sintética imitada llevó a la acumulación de miR-34a en el tejido tumoral e inhibición del crecimiento del tumor pulmonar. Últimamente, Ling et al. también mostraron que el supresor miR-22 mostró actividad anti-cáncer pulmonar mediante la regulación post-transcripción de ErbB3 [143]. Así, las miRNA terapéuticas imitadas tienen un potencial poderoso atacando genes múltiples relevantes para varias enfermedades. Sin embargo, es necesario prestar atención a la toxicidad potencial en los tejidos normales en condiciones en las que la administración terapéutica de miRNA imita conducirá a una acumulación de miRNAs exógenos en células normales [138]. Aunque las suposiciones están bien fundadas, todavía hay evidencia insuficiente de toxicidad causada por miRNA imitaciones. De hecho, varios estudios in vivo fallaron en revelar efectos secundarios causados por los miRNA imitaciones y sugirió que la entrega de miRNA imitaciones a tejidos normales fue bien tolerada [107, 141]. Será importante investigar los efectos miRNAs imitados en células normales y evaluar cuidadosamente la toxicidad antes de utilizarlos en la práctica clínica. La segunda estrategia se dirige a una ganancia de función y tiene como objetivo inhibir oncomiRs mediante el uso de anti-miRNAs. Las modificaciones químicas, como el grupo 2'-O-metilo y el ácido nucleico bloqueado (LNA), aumentarían la estabilidad del oligo contra las nucleasas [144]. Los oligonucleótidos antisensibles contenidos en estas modificaciones se denominan antagomirs o "LNA-antimiRs" [144, 145]. Son oligonucleótidos con secuencias complementarias al miRNA endógeno e inhiben la función específica del miRNA. Se ha demostrado que un LNA-antimiR contra miR-122 silencia efectivamente miR-122 en primates no humanos [145], y los hallazgos apoyan el potencial de estos compuestos como una nueva clase terapéutica. Además, también se ha reportado que los anti-miR-150 suministrados en el tumor pulmonar xenoinjertos en ratones llevaron a un crecimiento tumoral inhibido En relación con estudios sobre miRNA imitados, estudios con oligonucleótidos antisensibles han mostrado evidencia efectiva con oligonucleótidos desnudos, lo que ilustra el potencial de modificaciones químicas de oligonucleótidos para mejorar su estabilidad, resistencia a la RNASa y propiedades farmacológicas, por lo que la inhibición de la función miRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificados se ha convertido en un enfoque importante y ampliamente utilizado. Datos recientes del primer estudio de fase II en pacientes con infección crónica por VHC tratados con el antimiR-122 modificado por LNA mostraron que este compuesto fue bien tolerado y proporcionó supresión viral continua. Un número creciente de estudios han examinado el potencial terapéutico de los miRNAs. Recientemente, ha surgido la evidencia de roles para miRNAs en la determinación de resistencia a fármacos [147]. En esta situación, la combinación de miRNA imita o antimiR con quimioterapia puede potenciar la eficacia del tratamiento del cáncer en el futuro. Además, los miRNA relacionados con las células madre cancerosas pueden ampliar significativamente el campo de la terapia basada en miRNA y sugerir que los miRNAs pueden ser herramientas potenciales para destruir las células cancerosas asociadas con la resistencia a la terapia, recurrencia y metástasis [108, 148]. Por lo tanto, el principal desafío es el suministro exitoso y las modificaciones químicas de los miRNAs terapéuticos al tejido objetivo sin dañar los tejidos normales. Los enfoques basados en ARNi proporcionan una modalidad terapéutica prometedora para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. Uno de los mayores desafíos en la terapia basada en ARNi sigue siendo el método de entrega de los siRNAs terapéuticos y miRNAs a las células objetivo. Las aplicaciones de parto pulmonar son muy atractivas, ya que tienden a ser no invasivas, son localmente restringidas y pueden ser administradas por el paciente. Una intervención terapéutica realista, como la aerosolización, puede mejorar la administración de medicamentos en el lugar de acción y disminuir la exposición sistémica del paciente a la terapia, reduciendo así los efectos fuera de la diana. El avance de la entrega de siRNA pulmonar a la clínica ilustra que la terapia basada en ARNi ocupa un lugar central en el tratamiento futuro de las enfermedades pulmonares. Por otro lado, los miRNAs tienen la oportunidad de dirigir genes múltiples de una manera refinada, y la terapia basada en miRNA proporcionará un atractivo enfoque antitumoral y antiinflamatorio para diversas enfermedades pulmonares. En particular, la terapia antimiRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificado se ha convertido en una terapia potencial para enfermedades pulmonares porque los oligonucleótidos El aumento de la evidencia ha indicado que los miRNA cumplen funciones causales en una variedad de enfermedades pulmonares y han impulsado investigaciones sobre su potencial como dianas terapéuticas. Para el desarrollo futuro se requieren una mayor comprensión de los mecanismos detallados de la terapia basada en ARNi y la investigación de métodos de parto más eficaces. Estos nuevos enfoques podrían abrir nuevas vías para diversas enfermedades pulmonares y mejorar el resultado clínico de los pacientes.
|
¿Cuáles son los métodos más comunes para la administración inhalada de medicamentos?
| false
| 1,616
|
{
"text": [
"Metered dose inhalers (MDIs) and dry powder inhalers (DPIs)"
],
"answer_start": [
4624
]
}
|
Inhaladores de dosis medidas (IDM) e inhaladores de polvo seco (DPI)
|
641
|
Las plataformas terapéuticas de RNAi para las enfermedades pulmonareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816685/Fujita, Yu; Takeshita, Fumitaka; Kuwano, Kazuyoshi; Ochiya, Takahiro2013-02-06DOI:10.3390/ph6020223Licencia:cc-byAbstract: La interferencia del ARN (ARNi) se está convirtiendo rápidamente en un método importante para analizar las funciones genéticas en muchos eucariotas y promete el desarrollo de silenciamiento genético terapéutico. La inducción de RNAi se basa en los pequeños ARN silenciadores, que afectan a la degradación específica del ARN mensajero (ARNm). Los estudios de descubrimiento de fármacos y los tratamientos novedosos de los siRNAs están actualmente dirigidos a una amplia gama de enfermedades, incluyendo varias infecciones virales y cánceres. Las enfermedades pulmonares en general son blancos atractivos para las terapias de siRNAs debido a su letalidad y prevalencia. Además, el pulmón es accesible anatómicamente a los agentes terapéuticos a través de la vía intrapulmonar. Recientemente, la evidencia creciente indica que los miRNAs desempeñan un papel importante en las anomalías pulmonares, como la inflamación y la oncogénesis. Por lo tanto, los miRNAs están siendo dirigidos con fines terapéuticos. En esta revisión, presentamos estrategias para el parto de ARNi y discutimos el estado actual de la técnica RNAi basada en el arte para diversas enfermedades pulmonares. Texto: cirugía tradicional, Bivas-Benita et al. reportaron que no se produjo mortalidad como resultado del uso de Las aplicaciones endotraqueales están siendo utilizadas actualmente por muchos profesionales en el campo pulmonar [22, 34] ; esto es útil para estudiar la administración de fármacos pulmonares en ratones. Sin embargo, el enfoque es más complejo en humanos porque se utiliza una vía artificial para la entrega de medicamentos en los pulmones. Por lo tanto, el método se está utilizando en modelos animales para probar y evaluar su fiabilidad para posibles aplicaciones clínicas. Ruta intraqueal: bajo anestesia, la tráquea se expone quirúrgicamente, y se inserta un tubo o aguja a través de una incisión hecha entre los anillos traqueales. Complicaciones, tales como lesiones vasculares y fugas de aire, son posibles debido a la traqueotomía. b) Ruta endotraqueal: los siRNAs se rocian directamente desde la boca a los pulmones utilizando un aerolizador MicroSprayer ® (Penn-Century, Filadelfia, PA Es importante mantener una visión clara de la tráquea durante el procedimiento. El parto intranasal es otro método común de aplicación de fármacos pulmonares en estudios en animales. En muchos estudios, se ha demostrado éxito in vivo en la entrega de siRNAs a los pulmones intranasal [22, 35, 36 ]. Una configuración experimental de la entrega intranasal por pulverización o gotita es simple e indolora para el animal. Aunque el éxito en la entrega de siRNAs intranasal en roedores no puede ser completamente extrapolado al uso humano debido a las diferencias significativas en anatomía pulmonar [37], este enfoque tiene potencial para la aplicación clínica de siRNAs. Ensayos clínicos de fase II se han iniciado para el tratamiento de la infección por el virus sincitial respiratorio (RSV), haciendo uso de la aplicación intranasal de moléculas de siRNAs desnudas modificadas químicamente que se dirigen a los productos La entrada intranasal se ha utilizado durante mucho tiempo para administrar moléculas pequeñas, como proteínas, para el parto sistémico. Debido a que la mucosa nasal está altamente vascularizada, la entrega de un epitelio delgado de medicación a través de la superficie puede dar lugar a una rápida absorción del medicamento en la sangre. Por lo tanto, los siRNA administrados intranasalmente pueden depositarse en la nariz, y algunos de ellos pueden no poder llegar al tracto respiratorio inferior. De hecho, se ha informado que la aplicación intranasal de siRNAs no formulados dio lugar a una menor eficiencia de entrega y distribución pulmonar homogénea que la alcanzada con la aplicación intratraqueal [31]. El método intranasal es adecuado para algunas enfermedades pulmonares, como la infección respiratoria superior por VSR, y también tiene potencial para el parto sistémico en lugar de la entrega pulmonar de siRNAs. Por lo tanto, es importante considerar la vía de administración El uso de aerosoles para administrar medicamentos a los pulmones tiene un largo historial. La administración por inhalación es un método popular y no invasivo de administrar agentes a los pulmones. Hay varios dispositivos de inhalación disponibles para la entrega de medicamentos a los pulmones. Los inhaladores de dosis medidas (IDM) y los inhaladores de polvo seco (IDP) son los modos más comunes de administrar inhalación. Los inhaladores de dosis medidas son los inhaladores más utilizados para varias enfermedades pulmonares, como el asma, la bronquitis y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y un espaciador es un dispositivo externo que se une a una IDM para permitir una mejor administración de medicamentos mediante una mayor coordinación de la activación y la inhalación. Para la mayoría de los IDM, el propelente es uno o más gases llamados clorofluorocarbonos (CFC). Aunque los CFC en los medicamentos son seguros para que los pacientes inhalen, son perjudiciales para el medio ambiente. Por lo tanto, el desarrollo ulterior de los siRNA inhalables puede no ser la mejor manera de avanzar. Los DPI son dispositivos que entregan medicamentos a los pulmones en forma de polvo seco. El uso de los DPI ya ha demostrado ser prometedor para la entrega in vivo de macromoléculas terapéuticas como la insulina [39] y la heparina de bajo peso molecular [40] ; por lo tanto, podría ser un mejor dispositivo para la entrega de siRNAs a los pulmones. Las ventajas de los DPI son una mayor estabilidad y esterilidad de las biomoléculas sobre aerosoles líquidos y la formación libre de propelentes. Aunque los medicamentos se envían comúnmente a los pulmones por inhalación, la mayoría de los estudios in vivo que utilizan siRNAs se han basado en la entrega intratraqueal También se necesita un portador adecuado para proteger los ácidos nucleicos de la degradación debido a la fuerza de corte y al aumento de la temperatura durante el proceso de secado. Se ha demostrado el uso del secado por pulverización como técnica para la ingeniería de formulaciones en polvo seco de nanopartículas de siRNA, que podrían permitir la entrega local de siRNA biológicamente activo directamente al tejido pulmonar [24, 25]. En el futuro, la técnica es deseable para estimar el estudio in vivo sobre terapia de siRNA para inhalación. A largo plazo, anticipamos que habrá dispositivos más sofisticados para el uso clínico y que los que se están desarrollando serán más adecuados. Hay dos barreras principales para la entrega eficiente de siRNA pulmonar a las células del pulmón. La primera es la anatomía compleja y ramificada de los pulmones y barreras biomecánicas, como la capa de muco que cubre las células de las vías respiratorias [41, 42 La vía aérea consiste en bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y sacos alveolares. Todas estas estructuras contienen alvéolos, los diminutos sacos de aire en los que se produce el intercambio de gas. Generalmente se reconoce que el factor crítico para la entrega eficiente de siRNA depende de las propiedades de las partículas del fármaco ARNi en términos de tamaño, carga, forma, velocidad y densidad. Para la entrega eficiente de siRNA pulmonar, las partículas deben depositarse en el tracto respiratorio inferior. La deposición en la vía aérea se ve afectada por el tamaño de las partículas y la función pulmonar del paciente. Se encuentra que el tamaño de las partículas entre 1-5 μm es el más apropiado para la deposición en el tracto respiratorio inferior [23]. Además, la presencia de proteínas mucos y surfactantes, las acciones de aclaramiento mucociliar y la fagocitosis por Por lo tanto, los sistemas de parto generalmente requieren vectores de parto, y estos vectores necesitan ser diseñados con el fin de maximizar la deposición de siRNA en el área enferma del tracto respiratorio. Además, las barreras extracelulares al parto de siRNA también dependen de características fisiológicas del tracto respiratorio, que pueden cambiar con la enfermedad y características del paciente. En el estadio activo de la enfermedad pulmonar, las condiciones fisiológicas de las vías respiratorias podrían cambiar y tener un impacto significativo en la eficiencia del sistema de parto pulmonar. Durante la infección, inflamación y reacción alérgica, hay un aumento en la secreción de mucosidad junto con el aclaramiento mucociliar dañado [43]. Además, el asma y la EPOC son ambas condiciones inflamatorias crónicas del pulmón asociadas con "remodelación" estructural que no es apropiada para el mantenimiento de la función pulmonar normal [44]. Figura 2. Barreras extracelulares al parto de siRNA pulmonar. La característica anatómica del tracto respiratorio es su alto grado de ramificación. El moco alinea el epitelio respiratorio desde la cavidad nasal hasta los bronquios terminales. Las partículas depositadas en las células epiteliales ciliadas son rápidamente despejadas por las acciones de aclaramiento mucociliar. El muco y el aclaramiento mucociliar de las partículas atrapadas por mucosidad es un mecanismo de defensa pulmonar como barrera fisiológica. En las células alveolar, clara y alveolar tipo II se secretan en la superficie del epitelio alveolar, formando una capa delgada de surfactantes pulmonares. Los surfactantes actúan como barrera principal para el parto de siRNA porque reducen la eficiencia de la transfección. Además, los macrófagos ubicados en los alveolos absorbe Las partículas recogidas en los macrófagos se degradan posteriormente dentro de las células, los cuales presentan barreras importantes para el parto pulmonar dirigido; el segundo es el membrance de las células de las vías respiratorias y sus barreras intracelulares (Figura 3 ). Para el silenciamiento eficiente de los genes en los pulmones, los siRNAs deben ser entregados a su sitio de acción, ser estables, entrar en las células diana y estar presentes en el citoplasma a una concentración suficiente; una vez que los siRNAs alcanzan las células diana, deben ser transportados al citoplasma y llevados por Argonaute (Ago)2/complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que degrada los mRNAs y, posteriormente, suprime la expresión génica secuencia-específica; para que ocurra una endocitosis eficiente, las partículas deben tener un tamaño inferior a 150 nm. Las propiedades fisicoquímicas de los siRNA también juegan un papel significativo en el cruce de la membrana biológica. A pesar de su pequeño tamaño, la carga negativa y la degradabilidad química de las moléculas de siRNA les impiden cruzar fácilmente las membranas biológicas. Por lo tanto, los enfoques eficientes de siRNA necesitan superar esta limitación facilitando la captación celular. Una de las principales funciones de un vector de entrega es facilitar la captación celular de siRNA [46]. La complejación electrostática de moléculas de siRNA con lípidos y polímeros catiónicos ayuda a enmascarar su carga negativa neta. El complejo portador de siRNA con carga positiva interactúa con proteoglicanos aniónicos en la membrana celular, forma una vesícula endocítica, y entra en las células por endocitosis [47]. Después de la internalización celular, el complejo portador de siRNA en vesículas endocíticas es transportado a lo largo de microtúbulos a lisosomas que son colocalizados con el centro organizador de microtúbulos. Para evitar la degradación lisosómica, los siRNAs deben escapar del endosoma al citoplasma, donde pueden asociarse con la maquinaria ARNi. El escape endosomal es una barrera importante para la entrega eficiente de siRNA [48, 49]. El endosomal atrapamiento y la degradación lisosómica del siRNA y los portadores contribuyen a la baja eficiencia de transfección y es una dificultad importante para los vectores de entrega. Un agente de entrega ideal debe proteger los siRNAs de la degradación enzimática, facilitar la absorción celular, y promover la fuga endosomal dentro de las células con toxicidad insignificante. Se han reportado múltiples enfoques para la entrega de siRNAs, que van desde la administración directa relativamente simple de siRNAs con forma salina hasta enfoques de nanopartículas basadas en lípidos y polímeros y enfoques de conjugación y complejación de siRNAs [50]. La carga negativa y la degradabilidad química de los siRNAs bajo condiciones fisiológicamente relevantes hacen que su entrega sea un desafío importante. En consecuencia, la entrega de siRNAs generalmente requiere un vector o portadores para su transfección en las células diana. En general, se están evaluando vectores virales y no virales para la entrega de siRNAs a las células pulmonares. Algunos vectores virales, como retrovirus y adenovirus, han sido demostrados para mediar el silenciamiento genético en un modelo pulmonar in vitro [51] e inducir RNAi en una gama de tejidos animales [52]. Demostró que el siRNA mediado por lentivirus fue utilizado específicamente para derribar la expresión de la proteína nuclear 1 (NUPR1) in vivo, lo que resultó en un crecimiento tumoral inhibido [53]. Sin embargo, el parto basado en virus tiene varias desventajas. La respuesta inmune a los virus no sólo impide la entrega de genes sino que también tiene el potencial de causar complicaciones graves [54]. Casos recientes bien documentados, como la muerte de Jesse Gelsinger debido a complicaciones relacionadas con un vector de distribución adenoviral, destacan este problema [55]. Además, algunos vectores virales pueden insertar su genoma en posiciones aleatorias en el cromosoma huésped, lo que finalmente restringe la función génica [56].. Barreras intracelulares para la entrega de siRNA pulmonar. Las barreras a la internalización celular dependen de las propiedades superficiales del siRNA y los portadores (por ejemplo Después de que los siRNAs sean llevados exitosamente a las células diana por medio de endocitosis, las principales barreras para entregar siRNAs a su sitio de acción son la atrapación endosomal y la degradación lisosómica de siRNAs y portadores. Para dirigir el silenciamiento del gen diana, los siRNAs necesitan escapar del endosoma hacia el citoplasma, donde se asocian con el complejo silenciador inducido por Ago2/ARN (RISC) para dirigir la división de mRNAs con sitios de unión complementarios. Como alternativa a los vectores virales, los vectores no virales, incluyendo vectores basados en lípidos y polímeros, generalmente se han utilizado para la entrega de siRNAs a los pulmones debido a su toxicidad reducida [57]. Los vectores de entrega basados en lípidos se utilizan con éxito para producir siRNA in vitro e in vivo [58]. Los lípidos catiónicos están compuestos de cabeza cargada positivamente, un enlace e hidrofóbico. En general, los complejos basados en lípidos son fáciles de formular y se logra una buena eficacia de transfección debido a la interacción con la membrana celular cargada negativa. Muchos agentes de transfección de siRNA comerciales son sistemas de administración basados en lípidos, algunos de los cuales también se emplean para el parto pulmonar-DharmFECT [30], Oligofectamina [59], Lipofectamina [60] y TransIT-TKO [35]. Del mismo modo, los polímeros catiónicos también se han evaluado para la entrega de siRNA a las células pulmonares. Por otro lado, los vectores basados en lípidos también pueden inducir toxicidad y activación inespecífica de las respuestas inflamatorias de citocina e interferón [62, 63]. Aunque los vectores basados en polímero provocan una respuesta inmune relativamente menos fuerte que los vectores basados en lípidos, la administración efectiva de siRNA a un área local en enfermedades pulmonares requiere más atención al desarrollo de vectores de entrega no tóxicos. Un punto importante para la inhibición de la expresión génica mediada por siRNA es si los efectos observados son específicos y no debidos a efectos fuera de la meta y no están libres de respuestas potenciales de interferón [64, 65]. Curiosamente, algunos estudios han demostrado que fue posible administrar "siRNA desnuda" a ratones y regular un objetivo endógeno o exógeno sin inducir una respuesta de interferón [66]. Los siRNAs desnudos son degradados por las endonucleasas séricas y generalmente son eliminados por filtración glomerular, resultando en una corta semivida plasmática de < 10 min. Por lo tanto, algunos estudios de la entrega sistémica de siRNAs desnudos no han logrado reducir la regulación del gen objetivo [67, 68]. En contraste, también ha habido algunos éxitos en la entrega local de siRNAs desnudos a los pulmones [15, 16, 20, 31]. Algunos de ellos reportaron que el uso de vectores de distribución no mostró diferencia significativa en la eficiencia silenciadora de genes en comparación con la de los siRNAs desnudos [16, 35]. De hecho, en un ensayo clínico, se ha utilizado la entrega de siRNAs desnudos para el tratamiento de RSV [17, 38]. Esta evidencia exitosa puede ser debido a que los siRNAs desnudos para aplicaciones clínicas son altamente modificados químicamente para prevenir la degradación inducida por nucleasa y presumiblemente minimizar los efectos estimuladores inmunes. Aunque no está claro cómo los siRNAs desnudos cruzan la membrana celular, obtienen acceso al citoplasma y permanecen intactos para realizar su acción biológica, tanto los ensayos en animales como en humanos se han llevado a cabo exitosamente, mostrando la eficacia de los siRNAs desnudos (ALN-RSV01) que fueron administrados intranasalmente. Esta explicación no ha sido confirmada, pero el daño fisiológico de las células epiteliales respiratorias causadas por infección viral puede haber influido posiblemente en el misterio. El cambio activo en la membrana de células epiteliales de la vía aérea causada por enfermedad infecciosa podría afectar la internalización celular. Sin embargo, la ventaja de los siRNA desnudos sobre los vectores de parto en el tratamiento de enfermedades pulmonares es controvertida [69, 70]. Se requieren más investigaciones in vivo sobre los siRNA desnudos y los vectores no virales. La enfermedad pulmonar es una de las principales causas de muerte, y la disminución de la calidad de vida es responsable del sufrimiento de muchos pacientes. Varias enfermedades pulmonares hacen la vida extremadamente difícil para los pacientes, y los casos graves de estas enfermedades pulmonares pueden resultar en la muerte. Las altas tasas de muerte asociadas con el cáncer de pulmón se deben en parte al hecho de que es lamentablemente difícil de curar. Sobre todo, la EPOC es la cuarta causa de muerte en la mayoría de los países industrializados y se prevé que se convierta en tercera para 2020 [71]. Por lo tanto, se necesita una acción decisiva para frenar el aumento de la salud y la carga económica que esto representa. Las enfermedades pulmonares crónicas La aprobación de corticosteroides inhalados fue pionera en una nueva generación de terapia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, siendo la primera vez que se disponía de un producto antiinflamatorio para reducir la inflamación pulmonar característica en las vías respiratorias y la obstrucción asociada. Los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica. Sin embargo, se utilizan con limitaciones en la EPOC y asma de moderada a grave. Asimismo, el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares refractarias también depende de la terapia sistémica con corticosteroides. Muchos de estos pacientes también sufrieron diversos efectos secundarios del uso sistémico de corticosteroides, como aumento de peso e hiperglucemia no controlada. El tratamiento de la enfermedad pulmonar utilizando una orientación celular específica, así como técnicas RNAi, representan una estrategia novedosa y podrían proporcionar nuevas oportunidades en nanomedicina. Las aplicaciones pulmonares de siRNA in vivo son frecuentemente estudiadas y a menudo resultan en ensayos clínicos [57, 72]. Desde el descubrimiento de ARNi, el potencial terapéutico de los siRNAs ha sido rápidamente reconocido. En 2004, el primer ensayo clínico humano de terapia basada en ARNi se inició para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad con un siRNA dirigido al receptor de VEGF 1 entregado intravítreamente [73]. Se han realizado muchos estudios en los últimos años que involucran la entrega de siRNAs a los pulmones para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. La entrega a los pulmones será más importante para mover la tecnología de siRNAs a la clínica. Se están evaluando varias terapias basadas en siRNAs en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes condiciones, incluyendo enfermedades pulmonares como asma e infección por VSR. La Tabla 1 es un resumen de ensayos clínicos de terapias basadas en siRNAs [74]. El siRNA muestra potencial para el tratamiento de varias infecciones virales pulmonares, y se ha reportado que los tratamientos basados en el siRNA también pueden ser utilizados en el tratamiento de la gripe [13], el virus de la parainfluenza [35], el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) [14], y el VRS [35]. Sobre todo, el VRS es el objetivo terapéutico más prometedor de los siRNAs. El VRS es una causa común de infecciones respiratorias graves en lactantes y niños. También produce morbilidad y mortalidad significativas en poblaciones adultas inmunocomprometidas o ancianas [75]. No se dispone de una vacuna contra el VRS, y la única terapia antiviral aprobada para el VRS es indeseable para los pacientes pediátricos debido a su potencial teratogenicidad y eficacia limitada. El tratamiento basado en ARNi ha mostrado efectos prometedores en modelos murinos de infección por VRS [35]. El siRNA, ALN-RSV01, está dirigido contra el ARNm que codifica la proteína N del VRS que exhibe actividad anti-VRS específica in vitro e in vivo. Se entrega sin un vector de parto como aerosol nasal y se dirige al tracto respiratorio superior en lugar del área pulmonar inferior. ALN-RSV01 ha sido sometido a estudios completos de fase I intranasal e inhalación en adultos sanos y se ha encontrado que es generalmente bien tolerado [38]. Además, ALN-RSV01 ha sido evaluado en un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en pacientes trasplantados de pulmón con infección del tracto respiratorio RSV [76]. La administración de ALN-RSV01 a pacientes de trasplante de pulmón infectados por VRS fue segura y bien tolerada y asociada con una Basándose en estos resultados, se ha iniciado un ensayo multinacional más amplio, aleatorizado y doble ciego de fase IIb de ALN-RSV01 en pacientes con trasplante de pulmón para confirmar y extender estos hallazgos. El cáncer es un objetivo principal de la terapia basada en ARNi, ya que los oncogenes, los genes supresores de tumores mutados y varios otros genes que contribuyen a la progresión del tumor son objetivos potencialmente importantes para el silenciamiento de genes por ARNi. El cáncer de pulmón es uno de los tumores más frecuentes en todo el mundo con respecto a las tasas de incidencia y mortalidad. Los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican comúnmente en un estadio avanzado de la enfermedad y tienen opciones terapéuticas limitadas. La principal ventaja de la terapia ARNi en el cáncer podría ser la focalización simultánea de genes múltiples pertenecientes a diferentes vías celulares que participan en la progresión del tumor. La inhibición simultánea de varios genes también minimizaría el riesgo de resistencia a fármacos que normalmente se encuentran con terapias basadas en pequeñas moléculas, que involucran siRNAs y miRNAs. Ya ha habido mejoras significativas en los siRNAs para el tratamiento primario o metastásico del cáncer de pulmón al dirigirse a oncogenes como Akt1 [9], tumor de Wilms 1 (WT1) [12], genes sobreexpresados como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) [77], NUPR1 [53] y EZH2 [78]. Algunos de estos estudios han demostrado con éxito la eficacia de la terapia basada en ARNi mediante la administración intrapulmonar de siRNAs Aunque se deben diseñar estrategias para minimizar los efectos inmunoestimuladores fuera de objetivo y no específicos, estos datos sugieren que el silenciamiento del gen diana con siRNAs es una estrategia atractiva para la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón primario y metastásico. Actualmente hay algunos ensayos clínicos en curso que estiman la seguridad y eficacia de los fármacos basados en siRNAs para el tratamiento del cáncer. Atu027, un siRNA-lipoplex dirigido contra la proteína cinasa N3 (PKN3), previno la metástasis pulmonar en un ensayo de fase I de varios modelos de cáncer [79]. PKN3 es un efector aguas abajo de la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), que regula diversas respuestas celulares, incluyendo desarrollo, crecimiento y supervivencia [81]. Recientemente, PKN3 también ha sido considerado como una diana terapéutica adecuada para modular la angiogénesis tumoral debido a que la pérdida de análisis de función con Atu027 en células endoteliales primarias cultivadas mostró un papel esencial de PKN3 para la formación y migración de tubos endoteliales [79]. Atu027 puede ser considerado como un potencial siRNA para prevenir metástasis pulmonares y podría ser adecuado para prevenir metástasis hematógenas combinadas con terapia convencional del cáncer. La enfermedad pulmonar inflamatoria, también llamada EPOC, incluye una amplia gama de dolencias pulmonares. Estas enfermedades relacionadas incluyen asma, fibrosis pulmonar y bronquitis crónica. Están influenciadas por una combinación de componentes ambientales, genéticos y epigenéticos [82]. La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. La EPOC se asocia principalmente al tabaquismo, y estudios recientes que investigan la fisiopatología del enfisema han demostrado que el humo del cigarrillo puede causar que las células entren en la senescencia celular. Fumar puede causar senescencia a las células debido al daño del ADN a través del aumento del recambio celular, lo que a su vez conduce al acortamiento acelerado del telómero [84]. Últimamente, muchos estudios han investigado el papel de la senescencia celular en el desarrollo y la progresión de la EPOC [85]. Aunque varias clases de medicamentos, incluyendo corticosteroides inhalados, se utilizan para el tratamiento de la EPOC, ninguno de estos medicamentos ha demostrado mejorar significativamente la función pulmonar a largo plazo durante la progresión de la enfermedad. Muchas personas están desarrollando EPOC, y la causa de esta afección es complicada y no se comprende a fondo.Un factor clave es la susceptibilidad genética.Algunos estudios han mostrado una gran contribución genética a la variabilidad de la función pulmonar y EPOC [86, 87].Los polimorfismos en genes múltiples se han reportado asociados con EPOC [87], tales como factor de transcripción [por ejemplo factor nuclear-kappa B (NFoB)] [88], matriz extracelular (por ejemplo, matriz metaloproteinasa-12 (MMP-12)) [89, 90], citocinas [por ejemplo factor de necrosis tumoral (TNF)-α] [91], quimioquinas [por ejemplo. la interleucina (IL)-8, el receptor IL-8 y el receptor de quimiocina (CCR)1 [92, 93], y la apoptosis (por ejemplo, caspasa-3 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) [94, 95]. Muchos de ellos se han identificado como posibles blancos de la intervención terapéutica utilizando inhibidores de moléculas o antagonistas. Aunque varios tratamientos nuevos que se dirigen al proceso inflamatorio se encuentran ahora en desarrollo clínico, como inhibidores del TNF-α e inhibidores de la I-kappaB cinasa 2 (IKK2) [96, 97], los ensayos clínicos con siRNA nunca se han realizado en la EPOC. El retraso en el desarrollo de fármacos para la EPOC podría deberse a la aparición relativamente reciente de investigaciones que abordan la base molecular de la EPOC. Además, se necesitan más investigaciones para entender los mecanismos moleculares esenciales sobre la patogénesis de la EPOC y desarrollar técnicas de monitoreo para apoyar el desarrollo de terapias ARNi. Actualmente, no hay tratamientos disponibles que reduzcan la progresión de la EPOC o supriman la inflamación en las vías aéreas pequeñas y el parénquima pulmonar. El enfoque basado en los ARNi para las moléculas clave también tiene implicaciones potenciales para el tratamiento de la EPOC. El asma es también una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas caracterizada por síntomas variables y recurrentes y obstrucción reversible del flujo de aire. La Organización Mundial de la Salud estima que actualmente están afectadas 300 millones de personas y que, para el año 2025, otros 100 millones serán afectados por la enfermedad [98]. Los corticosteroides inhalados son muy eficaces en asma leve porque mejoran los síntomas y disminuyen las exacerbaciones. Aunque los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica para las enfermedades pulmonares inflamatorias, su uso no siempre es completamente efectivo y está asociado con efectos secundarios. Debido a estas limitaciones, está claro que hay una necesidad de nuevos tipos de medicamentos que pueden tratar y mejorar el pronóstico de asma moderada a grave. Se han identificado muchos genes diana que participan en la patogénesis del asma. Los objetivos más prometedores incluyen la codificación de genes para citoquinas (IL-4, IL5, IL-13), receptores de citoquinas y quimioquinas (IL-4 y CCR3), y tirosina quinasas [tirosina quinasa batida (Syk) y nuevas tirosina quinasa (Lyn) relacionadas con LCK/YES)], así como para factores de transcripción [transductores de señales y activadores de transcripción 1 (STAT1), STAT6, GATA3 y NF Actualmente, en un ensayo clínico para el asma, Excellair TM (ZaBeCor, Bala Cynwyd, PA, EE.UU.), se está utilizando un siRNA que se dirige a Syk. La cinasa está involucrada en la señalización de un receptor de células B y es un regulador clave de cascadas de señalización aguas abajo que en última instancia conducen a la activación de varios factores de transcripción proinflamatorios. Se ha reportado que los oligonucleótidos antisensibles administrados por aerosol fueron potentes para disminuir la expresión de Syk, liberación mediadora de macrófagos alveolares e inflamación pulmonar dependiente de Syk [102]. Además, se ha demostrado la inhibición de mediadores inflamatorios en un estudio utilizando siRNA dirigido a Syk en células epiteliales de vía aérea [103]. Algunos de los tratamientos actuales para el asma y otras condiciones inflamatorias, tales como inhibidores del TNF-α o inhibidores del leucotrieno, inhiben sólo uno de los mediadores de la inflamación. En contraste, el siRNA dirigido Syk busca inhibir un paso inicial de señalización de la inflamación y, por lo tanto, evitar la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. En general, el progreso reciente de los siRNAs a los pulmones también ha mejorado la viabilidad terapéutica de los ARNi para enfermedades pulmonares inflamatorias. El progreso rápido pondrá los tratamientos basados en el siRNA en una vía rápida a la clínica. MiRNAs son pequeños ARNs no codificantes endógenos que regulan la expresión génica reprimiendo la traducción o promoviendo la degradación de su mRNA objetivo. MiRNAs regulan la expresión génica mediante la unión a la 3′ región no traducida (UTR) de En el genoma humano, se estima que las transcripciones de aproximadamente el 60% de todos los ARNm están dirigidas por los miRNAs [104]. De acuerdo con su función, los miRNAs desempeñan un papel importante en los procesos celulares como desarrollo, proliferación y apoptosis de patologías pulmonares [105]. Se ha demostrado que un número creciente de miRNAs están involucrados en diferentes enfermedades pulmonares. Esta evidencia hace de los miRNAs una tecnología prometedora para el desarrollo terapéutico actual y futuro. Discutimos el papel de algunos miRNAs en diversas enfermedades pulmonares, así como el posible futuro de estos descubrimientos en aplicaciones clínicas.La Tabla 2 muestra el resumen de los miRNAs en el desarrollo terapéutico.En este punto, una terapia basada en miRNAs ya ha entrado en un ensayo clínico de fase II.Existe evidencia de que la regulación ascendente o descendente de los miRNAs es Muchos estudios se han centrado en el papel de los miRNAs en las enfermedades pulmonares inflamatorias, como la EPOC [116, 117], la fibrosis pulmonar [118] [118] [119] [129] y el asma [122] [123] [123] [125] [125] (Tabla 3). [130] [117, 129] La patogénesis de la EPOC se atribuye no sólo a la inflamación crónica en las vías respiratorias sino también a la inflamación sistémica [131]. El tabaquismo es el principal factor de riesgo para el desarrollo de la EPOC. Se ha demostrado que el tabaquismo causa cambios biológicos en la expresión génica de los pulmones [132], y hay algunos informes sobre los miRNAs relacionados con el tabaquismo [117, 129, 130]. Sin embargo, hay pocos informes que se centran en los miRNAs relacionados con la patogénesis de esta enfermedad con componentes inflamatorios sistémico El estudio reciente sobre fibroblastos pulmonares de pacientes con EPOC presenta menos expresión de miR-146a después de la estimulación con citocinas proinflamatorias en comparación con sujetos no EPOC con historias de tabaquismo similares [127]. La regulación descendente de miR-146a resultó en una vida media prolongada de ciclooxigenasa-2 del ARNm, aumentando así la prostaglandina E2 en fibroblastos de sujetos con EPOC. Además, Ezzie et al. investigaron la diferencia de perfiles de miRNA expresados en los pulmones de fumadores con y sin EPOC. Concluyeron que miR-223 y miR-1274a fueron los miRNA más afectados en sujetos con EPOC [126]. Sin embargo, la EPOC es un trastorno complejo, multicomponente y heterogéneo con una serie de diferentes procesos patológicos y subgrupos con sus propias características Se necesita una mejor comprensión de la complejidad de la enfermedad y de la potencial relevancia clínica de los miRNA identificados. La fibrosis pulmonar puede ser causada por una irritación identificable a los pulmones, pero en muchos casos se desconoce la causa, y las posibilidades terapéuticas son limitadas. El tabaquismo es uno de los factores de riesgo más reconocidos para el desarrollo de fibrosis pulmonar. Este trastorno se acompaña principalmente de una mayor expresión del mediador fibrótico clave que transforma el factor de crecimiento β (TGF-β) y otras citoquinas producidas en la lesión de fibrosis activa [128]. Recientemente, se informó que los miRNAs pueden desempeñar un papel regulador importante en el cambio fibromático pulmonar en los pulmones. La regulación descendente de let-7d en fibrosis pulmonar idiopática (IPF) resultó en un aumento de la deposición de colágeno y engrosamiento septal alveolar [119] En un modelo diferente de ratón asmático, se observó un aumento en la expresión de miR-21 en los pulmones [123]. Este informe podría contribuir a la comprensión del mecanismo inflamatorio en la vía aérea a través de la inhibición de IL-12, favoreciendo la respuesta de linfocitos Th2. Un receptor 4 (TLR4) inducido por Th2 induce una alta expresión de miR-126, y el bloqueo selectivo de miR-126 suprimió el fenotipo asmático [124]. Además, la remodelación de la vía aérea es una característica del asma y tiene importantes implicaciones funcionales. Rodríguez et al. han demostrado que miR-155 está relacionada con el desarrollo de infiltración inflamatoria en el pulmón y la remodelación de la vía aérea [122]. Así, algunos estudios presentan una conexión funcional entre la expresión de miRNA y la patogénesis del asma y sugieren que dirigir miRNA en las vías respiratorias puede conducir a tratamientos antiinflamatorios para el asma alérgica. A pesar de la evidencia de modelos experimentales, el perfil de expresión de miRNAs en biopsias de vías respiratorias de pacientes con asma leve antes y después del tratamiento con corticosteroides inhalados y en voluntarios sanos no reveló diferencias en la expresión de miRNAs [135]. Se requieren investigaciones adicionales sobre el papel de los miRNAs relacionados con la patogénesis del asma. Aunque la evidencia básica de la biología de miRNAs sigue proporcionando nuevas ideas, las aplicaciones de la terapia basada en miRNAs para enfermedades pulmonares inflamatorias son menos avanzadas que las del cáncer de pulmón [136]. Una razón de esto podría ser que la heterogeneidad de la enfermedad es causada por los efectos de muchos contaminantes ambientales del aire, incluyendo humo y compuestos orgánicos volátiles. La presencia de varios factores de riesgo complica la comprensión de la patogénesis de enfermedades pulmonares inflamatorias. La comprensión del papel que desempeñan los miRNAs en la modulación de la expresión génica, que conduce a sostener la patogénesis de las enfermedades pulmonares, es importante para el desarrollo de nuevas terapias que se centran en la prevención de la progresión de la enfermedad y el alivio de los síntomas. Dadas las importantes funciones que desempeñan los miRNAs en múltiples vías de carcinogénesis pulmonar, se están dedicando cada vez más esfuerzos a la investigación y desarrollo de terapias basadas en miRNAs, incluyendo la restauración de las funciones de miRNAs supresoras de tumores o la inhibición de miRNAs oncogénicos. El desarrollo de terapias basadas en miRNAs para el cáncer de pulmón está creciendo prósperamente con la ayuda de nuevas tecnologías ARNi. En comparación con las terapias basadas en siRNAs, que ya están en ensayos clínicos, los miRNAs son menos tóxicos y tienen el potencial de Los problemas críticos para el desarrollo de esta terapia son la entrega efectiva a los sitios de destino, la potencia de la terapia y la eliminación de los efectos fuera de la diana [137]. Hay dos estrategias como las aplicaciones terapéuticas de los miRNAs para el cáncer de pulmón [138]. Una estrategia es la terapia de reemplazo de miRNAs, que implica la reintroducción de un miRNA supresor tumoral imitado para restaurar una pérdida de la función. MiRNAs imitan a los duplex de ARN sintéticos diseñados para imitar las funciones endógenas de los miRNAs con modificaciones químicas para la estabilidad y la absorción celular. El concepto de terapia de reemplazo de miRNAs es más ejemplificado por el miRNAs let-7. let-7 es un miRNAs tumor-supresor en cáncer de pulmón no microcítico que se correlaciona inversamente con la expresión La administración intranasal de let-7 imitado en modelos de ratón de cáncer de pulmón redujo significativamente el crecimiento del tumor, lo que sugiere que la terapia de reemplazo de miRNA es realmente prometedora [106, 140, 141]. Otro miRNA que muestra el valor del reemplazo de miRNA es proporcionado por miR-34a [107, 142]. La administración local y/o sistémica de una miR-34a sintética imitada llevó a la acumulación de miR-34a en el tejido tumoral e inhibición del crecimiento del tumor pulmonar. Últimamente, Ling et al. también mostraron que el supresor miR-22 mostró actividad anti-cáncer pulmonar mediante la regulación post-transcripción de ErbB3 [143]. Así, las miRNA terapéuticas imitadas tienen un potencial poderoso atacando genes múltiples relevantes para varias enfermedades. Sin embargo, es necesario prestar atención a la toxicidad potencial en los tejidos normales en condiciones en las que la administración terapéutica de miRNA imita conducirá a una acumulación de miRNAs exógenos en células normales [138]. Aunque las suposiciones están bien fundadas, todavía hay evidencia insuficiente de toxicidad causada por miRNA imitaciones. De hecho, varios estudios in vivo fallaron en revelar efectos secundarios causados por los miRNA imitaciones y sugirió que la entrega de miRNA imitaciones a tejidos normales fue bien tolerada [107, 141]. Será importante investigar los efectos miRNAs imitados en células normales y evaluar cuidadosamente la toxicidad antes de utilizarlos en la práctica clínica. La segunda estrategia se dirige a una ganancia de función y tiene como objetivo inhibir oncomiRs mediante el uso de anti-miRNAs. Las modificaciones químicas, como el grupo 2'-O-metilo y el ácido nucleico bloqueado (LNA), aumentarían la estabilidad del oligo contra las nucleasas [144]. Los oligonucleótidos antisensibles contenidos en estas modificaciones se denominan antagomirs o "LNA-antimiRs" [144, 145]. Son oligonucleótidos con secuencias complementarias al miRNA endógeno e inhiben la función específica del miRNA. Se ha demostrado que un LNA-antimiR contra miR-122 silencia efectivamente miR-122 en primates no humanos [145], y los hallazgos apoyan el potencial de estos compuestos como una nueva clase terapéutica. Además, también se ha reportado que los anti-miR-150 suministrados en el tumor pulmonar xenoinjertos en ratones llevaron a un crecimiento tumoral inhibido En relación con estudios sobre miRNA imitados, estudios con oligonucleótidos antisensibles han mostrado evidencia efectiva con oligonucleótidos desnudos, lo que ilustra el potencial de modificaciones químicas de oligonucleótidos para mejorar su estabilidad, resistencia a la RNASa y propiedades farmacológicas, por lo que la inhibición de la función miRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificados se ha convertido en un enfoque importante y ampliamente utilizado. Datos recientes del primer estudio de fase II en pacientes con infección crónica por VHC tratados con el antimiR-122 modificado por LNA mostraron que este compuesto fue bien tolerado y proporcionó supresión viral continua. Un número creciente de estudios han examinado el potencial terapéutico de los miRNAs. Recientemente, ha surgido la evidencia de roles para miRNAs en la determinación de resistencia a fármacos [147]. En esta situación, la combinación de miRNA imita o antimiR con quimioterapia puede potenciar la eficacia del tratamiento del cáncer en el futuro. Además, los miRNA relacionados con las células madre cancerosas pueden ampliar significativamente el campo de la terapia basada en miRNA y sugerir que los miRNAs pueden ser herramientas potenciales para destruir las células cancerosas asociadas con la resistencia a la terapia, recurrencia y metástasis [108, 148]. Por lo tanto, el principal desafío es el suministro exitoso y las modificaciones químicas de los miRNAs terapéuticos al tejido objetivo sin dañar los tejidos normales. Los enfoques basados en ARNi proporcionan una modalidad terapéutica prometedora para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. Uno de los mayores desafíos en la terapia basada en ARNi sigue siendo el método de entrega de los siRNAs terapéuticos y miRNAs a las células objetivo. Las aplicaciones de parto pulmonar son muy atractivas, ya que tienden a ser no invasivas, son localmente restringidas y pueden ser administradas por el paciente. Una intervención terapéutica realista, como la aerosolización, puede mejorar la administración de fármacos en el lugar de acción y disminuir la exposición sistémica del paciente a la terapia, reduciendo así los efectos fuera de los objetivos. El avance de la entrega de siRNA pulmonar a la clínica ilustra que la terapia basada en ARNi ocupa un lugar central en el tratamiento futuro de las enfermedades pulmonares. Por otro lado, los miRNAs tienen la oportunidad de dirigir genes múltiples de una manera refinada, y la terapia basada en miRNA proporcionará un enfoque antitumoral y antiinflamatorio atractivo para diversas enfermedades pulmonares. En particular, la terapia antimiRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificado se ha convertido en una terapia potencial para las enfermedades pulmonares porque los oligonucleótidos El aumento de la evidencia ha indicado que los miRNA cumplen funciones causales en una variedad de enfermedades pulmonares y han impulsado investigaciones sobre su potencial como dianas terapéuticas. Para el desarrollo futuro se requieren una mayor comprensión de los mecanismos detallados de la terapia basada en ARNi y la investigación de métodos de parto más eficaces. Estos nuevos enfoques podrían abrir nuevas vías para diversas enfermedades pulmonares y mejorar el resultado clínico de los pacientes.
|
¿Qué medicamentos han demostrado ser una buena promesa para la entrega in vivo a través de inhaladores de polvo seco?
| false
| 1,617
|
{
"text": [
"insulin [39] and low-molecular-weight heparin [40]"
],
"answer_start": [
5473
]
}
|
insulina [39] y heparina de bajo peso molecular [40]
|
641
|
Las plataformas terapéuticas de RNAi para las enfermedades pulmonareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816685/Fujita, Yu; Takeshita, Fumitaka; Kuwano, Kazuyoshi; Ochiya, Takahiro2013-02-06DOI:10.3390/ph6020223Licencia:cc-byAbstract: La interferencia del ARN (ARNi) se está convirtiendo rápidamente en un método importante para analizar las funciones genéticas en muchos eucariotas y promete el desarrollo de silenciamiento genético terapéutico. La inducción de RNAi se basa en los pequeños ARN silenciadores, que afectan a la degradación específica del ARN mensajero (ARNm). Los estudios de descubrimiento de fármacos y los tratamientos novedosos de los siRNAs están actualmente dirigidos a una amplia gama de enfermedades, incluyendo varias infecciones virales y cánceres. Las enfermedades pulmonares en general son blancos atractivos para las terapias de siRNAs debido a su letalidad y prevalencia. Además, el pulmón es accesible anatómicamente a los agentes terapéuticos a través de la vía intrapulmonar. Recientemente, la evidencia creciente indica que los miRNAs desempeñan un papel importante en las anomalías pulmonares, como la inflamación y la oncogénesis. Por lo tanto, los miRNAs están siendo dirigidos con fines terapéuticos. En esta revisión, presentamos estrategias para el parto de ARNi y discutimos el estado actual de la técnica RNAi basada en el arte para diversas enfermedades pulmonares. Texto: cirugía tradicional, Bivas-Benita et al. reportaron que no se produjo mortalidad como resultado del uso de Las aplicaciones endotraqueales están siendo utilizadas actualmente por muchos profesionales en el campo pulmonar [22, 34] ; esto es útil para estudiar la administración de fármacos pulmonares en ratones. Sin embargo, el enfoque es más complejo en humanos porque se utiliza una vía artificial para la entrega de medicamentos en los pulmones. Por lo tanto, el método se está utilizando en modelos animales para probar y evaluar su fiabilidad para posibles aplicaciones clínicas. Ruta intraqueal: bajo anestesia, la tráquea se expone quirúrgicamente, y se inserta un tubo o aguja a través de una incisión hecha entre los anillos traqueales. Complicaciones, tales como lesiones vasculares y fugas de aire, son posibles debido a la traqueotomía. b) Ruta endotraqueal: los siRNAs se rocian directamente desde la boca a los pulmones utilizando un aerolizador MicroSprayer ® (Penn-Century, Filadelfia, PA Es importante mantener una visión clara de la tráquea durante el procedimiento. El parto intranasal es otro método común de aplicación de fármacos pulmonares en estudios en animales. En muchos estudios, se ha demostrado éxito in vivo en la entrega de siRNAs a los pulmones intranasal [22, 35, 36 ]. Una configuración experimental de la entrega intranasal por pulverización o gotita es simple e indolora para el animal. Aunque el éxito en la entrega de siRNAs intranasal en roedores no puede ser completamente extrapolado al uso humano debido a las diferencias significativas en anatomía pulmonar [37], este enfoque tiene potencial para la aplicación clínica de siRNAs. Ensayos clínicos de fase II se han iniciado para el tratamiento de la infección por el virus sincitial respiratorio (RSV), haciendo uso de la aplicación intranasal de moléculas de siRNAs desnudas modificadas químicamente que se dirigen a los productos La entrada intranasal se ha utilizado durante mucho tiempo para administrar moléculas pequeñas, como proteínas, para el parto sistémico. Debido a que la mucosa nasal está altamente vascularizada, la entrega de un epitelio delgado de medicación a través de la superficie puede dar lugar a una rápida absorción del medicamento en la sangre. Por lo tanto, los siRNA administrados intranasalmente pueden depositarse en la nariz, y algunos de ellos pueden no poder llegar al tracto respiratorio inferior. De hecho, se ha informado que la aplicación intranasal de siRNAs no formulados dio lugar a una menor eficiencia de entrega y distribución pulmonar homogénea que la alcanzada con la aplicación intratraqueal [31]. El método intranasal es adecuado para algunas enfermedades pulmonares, como la infección respiratoria superior por VSR, y también tiene potencial para el parto sistémico en lugar de la entrega pulmonar de siRNAs. Por lo tanto, es importante considerar la vía de administración El uso de aerosoles para administrar medicamentos a los pulmones tiene un largo historial. La administración por inhalación es un método popular y no invasivo de administrar agentes a los pulmones. Hay varios dispositivos de inhalación disponibles para la entrega de medicamentos a los pulmones. Los inhaladores de dosis medidas (IDM) y los inhaladores de polvo seco (IDP) son los modos más comunes de administrar inhalación. Los inhaladores de dosis medidas son los inhaladores más utilizados para varias enfermedades pulmonares, como el asma, la bronquitis y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y un espaciador es un dispositivo externo que se une a una IDM para permitir una mejor administración de medicamentos mediante una mayor coordinación de la activación y la inhalación. Para la mayoría de los IDM, el propelente es uno o más gases llamados clorofluorocarbonos (CFC). Aunque los CFC en los medicamentos son seguros para que los pacientes inhalen, son perjudiciales para el medio ambiente. Por lo tanto, el desarrollo ulterior de los siRNA inhalables puede no ser la mejor manera de avanzar. Los DPI son dispositivos que entregan medicamentos a los pulmones en forma de polvo seco. El uso de los DPI ya ha demostrado ser prometedor para la entrega in vivo de macromoléculas terapéuticas como la insulina [39] y la heparina de bajo peso molecular [40] ; por lo tanto, podría ser un mejor dispositivo para la entrega de siRNAs a los pulmones. Las ventajas de los DPI son una mayor estabilidad y esterilidad de las biomoléculas sobre aerosoles líquidos y la formación libre de propelentes. Aunque los medicamentos se envían comúnmente a los pulmones por inhalación, la mayoría de los estudios in vivo que utilizan siRNAs se han basado en la entrega intratraqueal También se necesita un portador adecuado para proteger los ácidos nucleicos de la degradación debido a la fuerza de corte y al aumento de la temperatura durante el proceso de secado. Se ha demostrado el uso del secado por pulverización como técnica para la ingeniería de formulaciones en polvo seco de nanopartículas de siRNA, que podrían permitir la entrega local de siRNA biológicamente activo directamente al tejido pulmonar [24, 25]. En el futuro, la técnica es deseable para estimar el estudio in vivo sobre terapia de siRNA para inhalación. A largo plazo, anticipamos que habrá dispositivos más sofisticados para el uso clínico y que los que se están desarrollando serán más adecuados. Hay dos barreras principales para la entrega eficiente de siRNA pulmonar a las células del pulmón. La primera es la anatomía compleja y ramificada de los pulmones y barreras biomecánicas, como la capa de muco que cubre las células de las vías respiratorias [41, 42 La vía aérea consiste en bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y sacos alveolares. Todas estas estructuras contienen alvéolos, los diminutos sacos de aire en los que se produce el intercambio de gas. Generalmente se reconoce que el factor crítico para la entrega eficiente de siRNA depende de las propiedades de las partículas del fármaco ARNi en términos de tamaño, carga, forma, velocidad y densidad. Para la entrega eficiente de siRNA pulmonar, las partículas deben depositarse en el tracto respiratorio inferior. La deposición en la vía aérea se ve afectada por el tamaño de las partículas y la función pulmonar del paciente. Se encuentra que el tamaño de las partículas entre 1-5 μm es el más apropiado para la deposición en el tracto respiratorio inferior [23]. Además, la presencia de proteínas mucos y surfactantes, las acciones de aclaramiento mucociliar y la fagocitosis por Por lo tanto, los sistemas de parto generalmente requieren vectores de parto, y estos vectores necesitan ser diseñados con el fin de maximizar la deposición de siRNA en el área enferma del tracto respiratorio. Además, las barreras extracelulares al parto de siRNA también dependen de características fisiológicas del tracto respiratorio, que pueden cambiar con la enfermedad y características del paciente. En el estadio activo de la enfermedad pulmonar, las condiciones fisiológicas de las vías respiratorias podrían cambiar y tener un impacto significativo en la eficiencia del sistema de parto pulmonar. Durante la infección, inflamación y reacción alérgica, hay un aumento en la secreción de mucosidad junto con el aclaramiento mucociliar dañado [43]. Además, el asma y la EPOC son ambas condiciones inflamatorias crónicas del pulmón asociadas con "remodelación" estructural que no es apropiada para el mantenimiento de la función pulmonar normal [44]. Figura 2. Barreras extracelulares al parto de siRNA pulmonar. La característica anatómica del tracto respiratorio es su alto grado de ramificación. El moco alinea el epitelio respiratorio desde la cavidad nasal hasta los bronquios terminales. Las partículas depositadas en las células epiteliales ciliadas son rápidamente despejadas por las acciones de aclaramiento mucociliar. El muco y el aclaramiento mucociliar de las partículas atrapadas por mucosidad es un mecanismo de defensa pulmonar como barrera fisiológica. En las células alveolar, clara y alveolar tipo II se secretan en la superficie del epitelio alveolar, formando una capa delgada de surfactantes pulmonares. Los surfactantes actúan como barrera principal para el parto de siRNA porque reducen la eficiencia de la transfección. Además, los macrófagos ubicados en los alveolos absorbe Las partículas recogidas en los macrófagos se degradan posteriormente dentro de las células, los cuales presentan barreras importantes para el parto pulmonar dirigido; el segundo es el membrance de las células de las vías respiratorias y sus barreras intracelulares (Figura 3 ). Para el silenciamiento eficiente de los genes en los pulmones, los siRNAs deben ser entregados a su sitio de acción, ser estables, entrar en las células diana y estar presentes en el citoplasma a una concentración suficiente; una vez que los siRNAs alcanzan las células diana, deben ser transportados al citoplasma y llevados por Argonaute (Ago)2/complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que degrada los mRNAs y, posteriormente, suprime la expresión génica secuencia-específica; para que ocurra una endocitosis eficiente, las partículas deben tener un tamaño inferior a 150 nm. Las propiedades fisicoquímicas de los siRNA también juegan un papel significativo en el cruce de la membrana biológica. A pesar de su pequeño tamaño, la carga negativa y la degradabilidad química de las moléculas de siRNA les impiden cruzar fácilmente las membranas biológicas. Por lo tanto, los enfoques eficientes de siRNA necesitan superar esta limitación facilitando la captación celular. Una de las principales funciones de un vector de entrega es facilitar la captación celular de siRNA [46]. La complejación electrostática de moléculas de siRNA con lípidos y polímeros catiónicos ayuda a enmascarar su carga negativa neta. El complejo portador de siRNA con carga positiva interactúa con proteoglicanos aniónicos en la membrana celular, forma una vesícula endocítica, y entra en las células por endocitosis [47]. Después de la internalización celular, el complejo portador de siRNA en vesículas endocíticas es transportado a lo largo de microtúbulos a lisosomas que son colocalizados con el centro organizador de microtúbulos. Para evitar la degradación lisosómica, los siRNAs deben escapar del endosoma al citoplasma, donde pueden asociarse con la maquinaria ARNi. El escape endosomal es una barrera importante para la entrega eficiente de siRNA [48, 49]. El endosomal atrapamiento y la degradación lisosómica del siRNA y los portadores contribuyen a la baja eficiencia de transfección y es una dificultad importante para los vectores de entrega. Un agente de entrega ideal debe proteger los siRNAs de la degradación enzimática, facilitar la absorción celular, y promover la fuga endosomal dentro de las células con toxicidad insignificante. Se han reportado múltiples enfoques para la entrega de siRNAs, que van desde la administración directa relativamente simple de siRNAs con forma salina hasta enfoques de nanopartículas basadas en lípidos y polímeros y enfoques de conjugación y complejación de siRNAs [50]. La carga negativa y la degradabilidad química de los siRNAs bajo condiciones fisiológicamente relevantes hacen que su entrega sea un desafío importante. En consecuencia, la entrega de siRNAs generalmente requiere un vector o portadores para su transfección en las células diana. En general, se están evaluando vectores virales y no virales para la entrega de siRNAs a las células pulmonares. Algunos vectores virales, como retrovirus y adenovirus, han sido demostrados para mediar el silenciamiento genético en un modelo pulmonar in vitro [51] e inducir RNAi en una gama de tejidos animales [52]. Demostró que el siRNA mediado por lentivirus fue utilizado específicamente para derribar la expresión de la proteína nuclear 1 (NUPR1) in vivo, lo que resultó en un crecimiento tumoral inhibido [53]. Sin embargo, el parto basado en virus tiene varias desventajas. La respuesta inmune a los virus no sólo impide la entrega de genes sino que también tiene el potencial de causar complicaciones graves [54]. Casos recientes bien documentados, como la muerte de Jesse Gelsinger debido a complicaciones relacionadas con un vector de distribución adenoviral, destacan este problema [55]. Además, algunos vectores virales pueden insertar su genoma en posiciones aleatorias en el cromosoma huésped, lo que finalmente restringe la función génica [56].. Barreras intracelulares para la entrega de siRNA pulmonar. Las barreras a la internalización celular dependen de las propiedades superficiales del siRNA y los portadores (por ejemplo Después de que los siRNAs sean llevados exitosamente a las células diana por medio de endocitosis, las principales barreras para entregar siRNAs a su sitio de acción son la atrapación endosomal y la degradación lisosómica de siRNAs y portadores. Para dirigir el silenciamiento del gen diana, los siRNAs necesitan escapar del endosoma hacia el citoplasma, donde se asocian con el complejo silenciador inducido por Ago2/ARN (RISC) para dirigir la división de mRNAs con sitios de unión complementarios. Como alternativa a los vectores virales, los vectores no virales, incluyendo vectores basados en lípidos y polímeros, generalmente se han utilizado para la entrega de siRNAs a los pulmones debido a su toxicidad reducida [57]. Los vectores de entrega basados en lípidos se utilizan con éxito para producir siRNA in vitro e in vivo [58]. Los lípidos catiónicos están compuestos de cabeza cargada positivamente, un enlace e hidrofóbico. En general, los complejos basados en lípidos son fáciles de formular y se logra una buena eficacia de transfección debido a la interacción con la membrana celular cargada negativa. Muchos agentes de transfección de siRNA comerciales son sistemas de administración basados en lípidos, algunos de los cuales también se emplean para el parto pulmonar-DharmFECT [30], Oligofectamina [59], Lipofectamina [60] y TransIT-TKO [35]. Del mismo modo, los polímeros catiónicos también se han evaluado para la entrega de siRNA a las células pulmonares. Por otro lado, los vectores basados en lípidos también pueden inducir toxicidad y activación inespecífica de las respuestas inflamatorias de citocina e interferón [62, 63]. Aunque los vectores basados en polímero provocan una respuesta inmune relativamente menos fuerte que los vectores basados en lípidos, la administración efectiva de siRNA a un área local en enfermedades pulmonares requiere más atención al desarrollo de vectores de entrega no tóxicos. Un punto importante para la inhibición de la expresión génica mediada por siRNA es si los efectos observados son específicos y no debidos a efectos fuera de la meta y no están libres de respuestas potenciales de interferón [64, 65]. Curiosamente, algunos estudios han demostrado que fue posible administrar "siRNA desnuda" a ratones y regular un objetivo endógeno o exógeno sin inducir una respuesta de interferón [66]. Los siRNAs desnudos son degradados por las endonucleasas séricas y generalmente son eliminados por filtración glomerular, resultando en una corta semivida plasmática de < 10 min. Por lo tanto, algunos estudios de la entrega sistémica de siRNAs desnudos no han logrado reducir la regulación del gen objetivo [67, 68]. En contraste, también ha habido algunos éxitos en la entrega local de siRNAs desnudos a los pulmones [15, 16, 20, 31]. Algunos de ellos reportaron que el uso de vectores de distribución no mostró diferencia significativa en la eficiencia silenciadora de genes en comparación con la de los siRNAs desnudos [16, 35]. De hecho, en un ensayo clínico, se ha utilizado la entrega de siRNAs desnudos para el tratamiento de RSV [17, 38]. Esta evidencia exitosa puede ser debido a que los siRNAs desnudos para aplicaciones clínicas son altamente modificados químicamente para prevenir la degradación inducida por nucleasa y presumiblemente minimizar los efectos estimuladores inmunes. Aunque no está claro cómo los siRNAs desnudos cruzan la membrana celular, obtienen acceso al citoplasma y permanecen intactos para realizar su acción biológica, tanto los ensayos en animales como en humanos se han llevado a cabo exitosamente, mostrando la eficacia de los siRNAs desnudos (ALN-RSV01) que fueron administrados intranasalmente. Esta explicación no ha sido confirmada, pero el daño fisiológico de las células epiteliales respiratorias causadas por infección viral puede haber influido posiblemente en el misterio. El cambio activo en la membrana de células epiteliales de la vía aérea causada por enfermedad infecciosa podría afectar la internalización celular. Sin embargo, la ventaja de los siRNA desnudos sobre los vectores de parto en el tratamiento de enfermedades pulmonares es controvertida [69, 70]. Se requieren más investigaciones in vivo sobre los siRNA desnudos y los vectores no virales. La enfermedad pulmonar es una de las principales causas de muerte, y la disminución de la calidad de vida es responsable del sufrimiento de muchos pacientes. Varias enfermedades pulmonares hacen la vida extremadamente difícil para los pacientes, y los casos graves de estas enfermedades pulmonares pueden resultar en la muerte. Las altas tasas de muerte asociadas con el cáncer de pulmón se deben en parte al hecho de que es lamentablemente difícil de curar. Sobre todo, la EPOC es la cuarta causa de muerte en la mayoría de los países industrializados y se prevé que se convierta en tercera para 2020 [71]. Por lo tanto, se necesita una acción decisiva para frenar el aumento de la salud y la carga económica que esto representa. Las enfermedades pulmonares crónicas La aprobación de corticosteroides inhalados fue pionera en una nueva generación de terapia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, siendo la primera vez que se disponía de un producto antiinflamatorio para reducir la inflamación pulmonar característica en las vías respiratorias y la obstrucción asociada. Los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica. Sin embargo, se utilizan con limitaciones en la EPOC y asma de moderada a grave. Asimismo, el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares refractarias también depende de la terapia sistémica con corticosteroides. Muchos de estos pacientes también sufrieron diversos efectos secundarios del uso sistémico de corticosteroides, como aumento de peso e hiperglucemia no controlada. El tratamiento de la enfermedad pulmonar utilizando una orientación celular específica, así como técnicas RNAi, representan una estrategia novedosa y podrían proporcionar nuevas oportunidades en nanomedicina. Las aplicaciones pulmonares de siRNA in vivo son frecuentemente estudiadas y a menudo resultan en ensayos clínicos [57, 72]. Desde el descubrimiento de ARNi, el potencial terapéutico de los siRNAs ha sido rápidamente reconocido. En 2004, el primer ensayo clínico humano de terapia basada en ARNi se inició para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad con un siRNA dirigido al receptor de VEGF 1 entregado intravítreamente [73]. Se han realizado muchos estudios en los últimos años que involucran la entrega de siRNAs a los pulmones para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. La entrega a los pulmones será más importante para mover la tecnología de siRNAs a la clínica. Se están evaluando varias terapias basadas en siRNAs en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes condiciones, incluyendo enfermedades pulmonares como asma e infección por VSR. La Tabla 1 es un resumen de ensayos clínicos de terapias basadas en siRNAs [74]. El siRNA muestra potencial para el tratamiento de varias infecciones virales pulmonares, y se ha reportado que los tratamientos basados en el siRNA también pueden ser utilizados en el tratamiento de la gripe [13], el virus de la parainfluenza [35], el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) [14], y el VRS [35]. Sobre todo, el VRS es el objetivo terapéutico más prometedor de los siRNAs. El VRS es una causa común de infecciones respiratorias graves en lactantes y niños. También produce morbilidad y mortalidad significativas en poblaciones adultas inmunocomprometidas o ancianas [75]. No se dispone de una vacuna contra el VRS, y la única terapia antiviral aprobada para el VRS es indeseable para los pacientes pediátricos debido a su potencial teratogenicidad y eficacia limitada. El tratamiento basado en ARNi ha mostrado efectos prometedores en modelos murinos de infección por VRS [35]. El siRNA, ALN-RSV01, está dirigido contra el ARNm que codifica la proteína N del VRS que exhibe actividad anti-VRS específica in vitro e in vivo. Se entrega sin un vector de parto como aerosol nasal y se dirige al tracto respiratorio superior en lugar del área pulmonar inferior. ALN-RSV01 ha sido sometido a estudios completos de fase I intranasal e inhalación en adultos sanos y se ha encontrado que es generalmente bien tolerado [38]. Además, ALN-RSV01 ha sido evaluado en un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en pacientes trasplantados de pulmón con infección del tracto respiratorio RSV [76]. La administración de ALN-RSV01 a pacientes de trasplante de pulmón infectados por VRS fue segura y bien tolerada y asociada con una Basándose en estos resultados, se ha iniciado un ensayo multinacional más amplio, aleatorizado y doble ciego de fase IIb de ALN-RSV01 en pacientes con trasplante de pulmón para confirmar y extender estos hallazgos. El cáncer es un objetivo principal de la terapia basada en ARNi, ya que los oncogenes, los genes supresores de tumores mutados y varios otros genes que contribuyen a la progresión del tumor son objetivos potencialmente importantes para el silenciamiento de genes por ARNi. El cáncer de pulmón es uno de los tumores más frecuentes en todo el mundo con respecto a las tasas de incidencia y mortalidad. Los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican comúnmente en un estadio avanzado de la enfermedad y tienen opciones terapéuticas limitadas. La principal ventaja de la terapia ARNi en el cáncer podría ser la focalización simultánea de genes múltiples pertenecientes a diferentes vías celulares que participan en la progresión del tumor. La inhibición simultánea de varios genes también minimizaría el riesgo de resistencia a fármacos que normalmente se encuentran con terapias basadas en pequeñas moléculas, que involucran siRNAs y miRNAs. Ya ha habido mejoras significativas en los siRNAs para el tratamiento primario o metastásico del cáncer de pulmón al dirigirse a oncogenes como Akt1 [9], tumor de Wilms 1 (WT1) [12], genes sobreexpresados como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) [77], NUPR1 [53] y EZH2 [78]. Algunos de estos estudios han demostrado con éxito la eficacia de la terapia basada en ARNi mediante la administración intrapulmonar de siRNAs Aunque se deben diseñar estrategias para minimizar los efectos inmunoestimuladores fuera de objetivo y no específicos, estos datos sugieren que el silenciamiento del gen diana con siRNAs es una estrategia atractiva para la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón primario y metastásico. Actualmente hay algunos ensayos clínicos en curso que estiman la seguridad y eficacia de los fármacos basados en siRNAs para el tratamiento del cáncer. Atu027, un siRNA-lipoplex dirigido contra la proteína cinasa N3 (PKN3), previno la metástasis pulmonar en un ensayo de fase I de varios modelos de cáncer [79]. PKN3 es un efector aguas abajo de la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), que regula diversas respuestas celulares, incluyendo desarrollo, crecimiento y supervivencia [81]. Recientemente, PKN3 también ha sido considerado como una diana terapéutica adecuada para modular la angiogénesis tumoral debido a que la pérdida de análisis de función con Atu027 en células endoteliales primarias cultivadas mostró un papel esencial de PKN3 para la formación y migración de tubos endoteliales [79]. Atu027 puede ser considerado como un potencial siRNA para prevenir metástasis pulmonares y podría ser adecuado para prevenir metástasis hematógenas combinadas con terapia convencional del cáncer. La enfermedad pulmonar inflamatoria, también llamada EPOC, incluye una amplia gama de dolencias pulmonares. Estas enfermedades relacionadas incluyen asma, fibrosis pulmonar y bronquitis crónica. Están influenciadas por una combinación de componentes ambientales, genéticos y epigenéticos [82]. La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. La EPOC se asocia principalmente al tabaquismo, y estudios recientes que investigan la fisiopatología del enfisema han demostrado que el humo del cigarrillo puede causar que las células entren en la senescencia celular. Fumar puede causar senescencia a las células debido al daño del ADN a través del aumento del recambio celular, lo que a su vez conduce al acortamiento acelerado del telómero [84]. Últimamente, muchos estudios han investigado el papel de la senescencia celular en el desarrollo y la progresión de la EPOC [85]. Aunque varias clases de medicamentos, incluyendo corticosteroides inhalados, se utilizan para el tratamiento de la EPOC, ninguno de estos medicamentos ha demostrado mejorar significativamente la función pulmonar a largo plazo durante la progresión de la enfermedad. Muchas personas están desarrollando EPOC, y la causa de esta afección es complicada y no se comprende a fondo.Un factor clave es la susceptibilidad genética.Algunos estudios han mostrado una gran contribución genética a la variabilidad de la función pulmonar y EPOC [86, 87].Los polimorfismos en genes múltiples se han reportado asociados con EPOC [87], tales como factor de transcripción [por ejemplo factor nuclear-kappa B (NFoB)] [88], matriz extracelular (por ejemplo, matriz metaloproteinasa-12 (MMP-12)) [89, 90], citocinas [por ejemplo factor de necrosis tumoral (TNF)-α] [91], quimioquinas [por ejemplo. la interleucina (IL)-8, el receptor IL-8 y el receptor de quimiocina (CCR)1 [92, 93], y la apoptosis (por ejemplo, caspasa-3 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) [94, 95]. Muchos de ellos se han identificado como posibles blancos de la intervención terapéutica utilizando inhibidores de moléculas o antagonistas. Aunque varios tratamientos nuevos que se dirigen al proceso inflamatorio se encuentran ahora en desarrollo clínico, como inhibidores del TNF-α e inhibidores del complejo I-kappaB cinasa 2 (IKK2) [96, 97], los ensayos clínicos con siRNA nunca se han realizado en la EPOC. El retraso en el desarrollo de fármacos para la EPOC podría deberse a la aparición relativamente reciente de investigaciones que abordan la base molecular de la EPOC. Además, se necesitan más investigaciones para entender los mecanismos moleculares esenciales sobre la patogénesis de la EPOC y desarrollar técnicas de monitoreo para apoyar el desarrollo de terapias ARNi. Actualmente, no hay tratamientos disponibles que reduzcan la progresión de la EPOC o supriman la inflamación en las vías aéreas pequeñas y el parénquima pulmonar. El enfoque basado en los ARNi para las moléculas clave también tiene implicaciones potenciales para el tratamiento de la EPOC. El asma es también una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas caracterizada por síntomas variables y recurrentes y obstrucción reversible del flujo de aire. La Organización Mundial de la Salud estima que actualmente están afectadas 300 millones de personas y que, para el año 2025, otros 100 millones serán afectados por la enfermedad [98]. Los corticosteroides inhalados son muy eficaces en asma leve porque mejoran los síntomas y disminuyen las exacerbaciones. Aunque los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica para las enfermedades pulmonares inflamatorias, su uso no siempre es completamente efectivo y está asociado con efectos secundarios. Debido a estas limitaciones, está claro que hay una necesidad de nuevos tipos de medicamentos que pueden tratar y mejorar el pronóstico de asma moderada a grave. Se han identificado muchos genes diana que participan en la patogénesis del asma. Los objetivos más prometedores incluyen la codificación de genes para citoquinas (IL-4, IL5, IL-13), receptores de citoquinas y quimioquinas (IL-4 y CCR3), y tirosina quinasas [tirosina quinasa batida (Syk) y nuevas tirosina quinasa (Lyn) relacionadas con LCK/YES)], así como para factores de transcripción [transductores de señales y activadores de transcripción 1 (STAT1), STAT6, GATA3 y NF Actualmente, en un ensayo clínico para el asma, Excellair TM (ZaBeCor, Bala Cynwyd, PA, EE.UU.), se está utilizando un siRNA que se dirige a Syk. La cinasa está involucrada en la señalización de un receptor de células B y es un regulador clave de cascadas de señalización aguas abajo que en última instancia conducen a la activación de varios factores de transcripción proinflamatorios. Se ha reportado que los oligonucleótidos antisensibles administrados por aerosol fueron potentes para disminuir la expresión de Syk, liberación mediadora de macrófagos alveolares e inflamación pulmonar dependiente de Syk [102]. Además, se ha demostrado la inhibición de mediadores inflamatorios en un estudio utilizando siRNA dirigido a Syk en células epiteliales de vía aérea [103]. Algunos de los tratamientos actuales para el asma y otras condiciones inflamatorias, tales como inhibidores del TNF-α o inhibidores del leucotrieno, inhiben sólo uno de los mediadores de la inflamación. En contraste, el siRNA dirigido Syk busca inhibir un paso inicial de señalización de la inflamación y, por lo tanto, evitar la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. En general, el progreso reciente de los siRNAs a los pulmones también ha mejorado la viabilidad terapéutica de los ARNi para enfermedades pulmonares inflamatorias. El progreso rápido pondrá los tratamientos basados en el siRNA en una vía rápida a la clínica. MiRNAs son pequeños ARNs no codificantes endógenos que regulan la expresión génica reprimiendo la traducción o promoviendo la degradación de su mRNA objetivo. MiRNAs regulan la expresión génica mediante la unión a la 3′ región no traducida (UTR) de En el genoma humano, se estima que las transcripciones de aproximadamente el 60% de todos los ARNm están dirigidas por los miRNAs [104]. De acuerdo con su función, los miRNAs desempeñan un papel importante en los procesos celulares como desarrollo, proliferación y apoptosis de patologías pulmonares [105]. Se ha demostrado que un número creciente de miRNAs están involucrados en diferentes enfermedades pulmonares. Esta evidencia hace de los miRNAs una tecnología prometedora para el desarrollo terapéutico actual y futuro. Discutimos el papel de algunos miRNAs en diversas enfermedades pulmonares, así como el posible futuro de estos descubrimientos en aplicaciones clínicas.La Tabla 2 muestra el resumen de los miRNAs en el desarrollo terapéutico.En este punto, una terapia basada en miRNAs ya ha entrado en un ensayo clínico de fase II.Existe evidencia de que la regulación ascendente o descendente de los miRNAs es Muchos estudios se han centrado en el papel de los miRNAs en las enfermedades pulmonares inflamatorias, como la EPOC [116, 117], la fibrosis pulmonar [118] [118] [119] [129] y el asma [122] [123] [123] [125] [125] (Tabla 3). [130] [117, 129] La patogénesis de la EPOC se atribuye no sólo a la inflamación crónica en las vías respiratorias sino también a la inflamación sistémica [131]. El tabaquismo es el principal factor de riesgo para el desarrollo de la EPOC. Se ha demostrado que el tabaquismo causa cambios biológicos en la expresión génica de los pulmones [132], y hay algunos informes sobre los miRNAs relacionados con el tabaquismo [117, 129, 130]. Sin embargo, hay pocos informes que se centran en los miRNAs relacionados con la patogénesis de esta enfermedad con componentes inflamatorios sistémico El estudio reciente sobre fibroblastos pulmonares de pacientes con EPOC presenta menos expresión de miR-146a después de la estimulación con citocinas proinflamatorias en comparación con sujetos no EPOC con historias de tabaquismo similares [127]. La regulación descendente de miR-146a resultó en una vida media prolongada de ciclooxigenasa-2 del ARNm, aumentando así la prostaglandina E2 en fibroblastos de sujetos con EPOC. Además, Ezzie et al. investigaron la diferencia de perfiles de miRNA expresados en los pulmones de fumadores con y sin EPOC. Concluyeron que miR-223 y miR-1274a fueron los miRNA más afectados en sujetos con EPOC [126]. Sin embargo, la EPOC es un trastorno complejo, multicomponente y heterogéneo con una serie de diferentes procesos patológicos y subgrupos con sus propias características Se necesita una mejor comprensión de la complejidad de la enfermedad y de la potencial relevancia clínica de los miRNA identificados. La fibrosis pulmonar puede ser causada por una irritación identificable a los pulmones, pero en muchos casos se desconoce la causa, y las posibilidades terapéuticas son limitadas. El tabaquismo es uno de los factores de riesgo más reconocidos para el desarrollo de fibrosis pulmonar. Este trastorno se acompaña principalmente de una mayor expresión del mediador fibrótico clave que transforma el factor de crecimiento β (TGF-β) y otras citoquinas producidas en la lesión de fibrosis activa [128]. Recientemente, se informó que los miRNAs pueden desempeñar un papel regulador importante en el cambio fibromático pulmonar en los pulmones. La regulación descendente de let-7d en fibrosis pulmonar idiopática (IPF) resultó en un aumento de la deposición de colágeno y engrosamiento septal alveolar [119] En un modelo diferente de ratón asmático, se observó un aumento en la expresión de miR-21 en los pulmones [123]. Este informe podría contribuir a la comprensión del mecanismo inflamatorio en la vía aérea a través de la inhibición de IL-12, favoreciendo la respuesta de linfocitos Th2. Un receptor 4 (TLR4) inducido por Th2 induce una alta expresión de miR-126, y el bloqueo selectivo de miR-126 suprimió el fenotipo asmático [124]. Además, la remodelación de la vía aérea es una característica del asma y tiene importantes implicaciones funcionales. Rodríguez et al. han demostrado que miR-155 está relacionada con el desarrollo de infiltración inflamatoria en el pulmón y la remodelación de la vía aérea [122]. Así, algunos estudios presentan una conexión funcional entre la expresión de miRNA y la patogénesis del asma y sugieren que dirigir miRNA en las vías respiratorias puede conducir a tratamientos antiinflamatorios para el asma alérgica. A pesar de la evidencia de modelos experimentales, el perfil de expresión de miRNAs en biopsias de vías respiratorias de pacientes con asma leve antes y después del tratamiento con corticosteroides inhalados y en voluntarios sanos no reveló diferencias en la expresión de miRNAs [135]. Se requieren investigaciones adicionales sobre el papel de los miRNAs relacionados con la patogénesis del asma. Aunque la evidencia básica de la biología de miRNAs sigue proporcionando nuevas ideas, las aplicaciones de la terapia basada en miRNAs para enfermedades pulmonares inflamatorias son menos avanzadas que las del cáncer de pulmón [136]. Una razón de esto podría ser que la heterogeneidad de la enfermedad es causada por los efectos de muchos contaminantes ambientales del aire, incluyendo humo y compuestos orgánicos volátiles. La presencia de varios factores de riesgo complica la comprensión de la patogénesis de enfermedades pulmonares inflamatorias. La comprensión del papel que desempeñan los miRNAs en la modulación de la expresión génica, que conduce a sostener la patogénesis de las enfermedades pulmonares, es importante para el desarrollo de nuevas terapias que se centran en la prevención de la progresión de la enfermedad y el alivio de los síntomas. Dadas las importantes funciones que desempeñan los miRNAs en múltiples vías de carcinogénesis pulmonar, se están dedicando cada vez más esfuerzos a la investigación y desarrollo de terapias basadas en miRNAs, incluyendo la restauración de las funciones de miRNAs supresoras de tumores o la inhibición de miRNAs oncogénicos. El desarrollo de terapias basadas en miRNAs para el cáncer de pulmón está creciendo prósperamente con la ayuda de nuevas tecnologías ARNi. En comparación con las terapias basadas en siRNAs, que ya están en ensayos clínicos, los miRNAs son menos tóxicos y tienen el potencial de Los problemas críticos para el desarrollo de esta terapia son la entrega efectiva a los sitios de destino, la potencia de la terapia y la eliminación de los efectos fuera de la diana [137]. Hay dos estrategias como las aplicaciones terapéuticas de los miRNAs para el cáncer de pulmón [138]. Una estrategia es la terapia de reemplazo de miRNAs, que implica la reintroducción de un miRNA supresor tumoral imitado para restaurar una pérdida de la función. MiRNAs imitan a los duplex de ARN sintéticos diseñados para imitar las funciones endógenas de los miRNAs con modificaciones químicas para la estabilidad y la absorción celular. El concepto de terapia de reemplazo de miRNAs es más ejemplificado por el miRNAs let-7. let-7 es un miRNAs tumor-supresor en cáncer de pulmón no microcítico que se correlaciona inversamente con la expresión La administración intranasal de let-7 imitado en modelos de ratón de cáncer de pulmón redujo significativamente el crecimiento del tumor, lo que sugiere que la terapia de reemplazo de miRNA es realmente prometedora [106, 140, 141]. Otro miRNA que muestra el valor del reemplazo de miRNA es proporcionado por miR-34a [107, 142]. La administración local y/o sistémica de una miR-34a sintética imitada llevó a la acumulación de miR-34a en el tejido tumoral e inhibición del crecimiento del tumor pulmonar. Últimamente, Ling et al. también mostraron que el supresor miR-22 mostró actividad anti-cáncer pulmonar mediante la regulación post-transcripción de ErbB3 [143]. Así, las miRNA terapéuticas imitadas tienen un potencial poderoso atacando genes múltiples relevantes para varias enfermedades. Sin embargo, es necesario prestar atención a la toxicidad potencial en los tejidos normales en condiciones en las que la administración terapéutica de miRNA imita conducirá a una acumulación de miRNAs exógenos en células normales [138]. Aunque las suposiciones están bien fundadas, todavía hay evidencia insuficiente de toxicidad causada por miRNA imitaciones. De hecho, varios estudios in vivo fallaron en revelar efectos secundarios causados por los miRNA imitaciones y sugirió que la entrega de miRNA imitaciones a tejidos normales fue bien tolerada [107, 141]. Será importante investigar los efectos miRNAs imitados en células normales y evaluar cuidadosamente la toxicidad antes de utilizarlos en la práctica clínica. La segunda estrategia se dirige a una ganancia de función y tiene como objetivo inhibir oncomiRs mediante el uso de anti-miRNAs. Las modificaciones químicas, como el grupo 2'-O-metilo y el ácido nucleico bloqueado (LNA), aumentarían la estabilidad del oligo contra las nucleasas [144]. Los oligonucleótidos antisensibles contenidos en estas modificaciones se denominan antagomirs o "LNA-antimiRs" [144, 145]. Son oligonucleótidos con secuencias complementarias al miRNA endógeno e inhiben la función específica del miRNA. Se ha demostrado que un LNA-antimiR contra miR-122 silencia efectivamente miR-122 en primates no humanos [145], y los hallazgos apoyan el potencial de estos compuestos como una nueva clase terapéutica. Además, también se ha reportado que los anti-miR-150 suministrados en el tumor pulmonar xenoinjertos en ratones llevaron a un crecimiento tumoral inhibido En relación con estudios sobre miRNA imitados, estudios con oligonucleótidos antisensibles han mostrado evidencia efectiva con oligonucleótidos desnudos, lo que ilustra el potencial de modificaciones químicas de oligonucleótidos para mejorar su estabilidad, resistencia a la RNASa y propiedades farmacológicas, por lo que la inhibición de la función miRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificados se ha convertido en un enfoque importante y ampliamente utilizado. Datos recientes del primer estudio de fase II en pacientes con infección crónica por VHC tratados con el antimiR-122 modificado por LNA mostraron que este compuesto fue bien tolerado y proporcionó supresión viral continua. Un número creciente de estudios han examinado el potencial terapéutico de los miRNAs. Recientemente, ha surgido la evidencia de roles para miRNAs en la determinación de resistencia a fármacos [147]. En esta situación, la combinación de miRNA imita o antimiR con quimioterapia puede potenciar la eficacia del tratamiento del cáncer en el futuro. Además, los miRNA relacionados con las células madre cancerosas pueden ampliar significativamente el campo de la terapia basada en miRNA y sugerir que los miRNAs pueden ser herramientas potenciales para destruir las células cancerosas asociadas con la resistencia a la terapia, recurrencia y metástasis [108, 148]. Por lo tanto, el principal desafío es el suministro exitoso y las modificaciones químicas de los miRNAs terapéuticos al tejido objetivo sin dañar los tejidos normales. Los enfoques basados en ARNi proporcionan una modalidad terapéutica prometedora para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. Uno de los mayores desafíos en la terapia basada en ARNi sigue siendo el método de entrega de los siRNAs terapéuticos y miRNAs a las células objetivo. Las aplicaciones de parto pulmonar son muy atractivas, ya que tienden a ser no invasivas, son localmente restringidas y pueden ser administradas por el paciente. Una intervención terapéutica realista, como la aerosolización, puede mejorar la administración de medicamentos en el lugar de acción y disminuir la exposición sistémica del paciente a la terapia, reduciendo así los efectos fuera de la diana. El avance de la entrega de siRNA pulmonar a la clínica ilustra que la terapia basada en ARNi ocupa un lugar central en el tratamiento futuro de las enfermedades pulmonares. Por otro lado, los miRNAs tienen la oportunidad de dirigir genes múltiples de una manera refinada, y la terapia basada en miRNA proporcionará un atractivo enfoque antitumoral y antiinflamatorio para diversas enfermedades pulmonares. En particular, la terapia antimiRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificado se ha convertido en una terapia potencial para enfermedades pulmonares porque los oligonucleótidos El aumento de la evidencia ha indicado que los miRNA cumplen funciones causales en una variedad de enfermedades pulmonares y han impulsado investigaciones sobre su potencial como dianas terapéuticas. Para el desarrollo futuro se requieren una mayor comprensión de los mecanismos detallados de la terapia basada en ARNi y la investigación de métodos de parto más eficaces. Estos nuevos enfoques podrían abrir nuevas vías para diversas enfermedades pulmonares y mejorar el resultado clínico de los pacientes.
|
¿Cómo se administran los siRNA típicamente para el efecto sistémico?
| false
| 1,618
|
{
"text": [
"intratracheal or intranasal delivery"
],
"answer_start": [
5840
]
}
|
parto intratraqueal o intranasal
|
641
|
Las plataformas terapéuticas de RNAi para las enfermedades pulmonareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816685/Fujita, Yu; Takeshita, Fumitaka; Kuwano, Kazuyoshi; Ochiya, Takahiro2013-02-06DOI:10.3390/ph6020223Licencia:cc-byAbstract: La interferencia del ARN (ARNi) se está convirtiendo rápidamente en un método importante para analizar las funciones genéticas en muchos eucariotas y promete el desarrollo de silenciamiento genético terapéutico. La inducción de RNAi se basa en los pequeños ARN silenciadores, que afectan a la degradación específica del ARN mensajero (ARNm). Los estudios de descubrimiento de fármacos y los tratamientos novedosos de los siRNAs están actualmente dirigidos a una amplia gama de enfermedades, incluyendo varias infecciones virales y cánceres. Las enfermedades pulmonares en general son blancos atractivos para las terapias de siRNAs debido a su letalidad y prevalencia. Además, el pulmón es accesible anatómicamente a los agentes terapéuticos a través de la vía intrapulmonar. Recientemente, la evidencia creciente indica que los miRNAs desempeñan un papel importante en las anomalías pulmonares, como la inflamación y la oncogénesis. Por lo tanto, los miRNAs están siendo dirigidos con fines terapéuticos. En esta revisión, presentamos estrategias para el parto de ARNi y discutimos el estado actual de la técnica RNAi basada en el arte para diversas enfermedades pulmonares. Texto: cirugía tradicional, Bivas-Benita et al. reportaron que no se produjo mortalidad como resultado del uso de Las aplicaciones endotraqueales están siendo utilizadas actualmente por muchos profesionales en el campo pulmonar [22, 34] ; esto es útil para estudiar la administración de fármacos pulmonares en ratones. Sin embargo, el enfoque es más complejo en humanos porque se utiliza una vía artificial para la entrega de medicamentos en los pulmones. Por lo tanto, el método se está utilizando en modelos animales para probar y evaluar su fiabilidad para posibles aplicaciones clínicas. Ruta intraqueal: bajo anestesia, la tráquea se expone quirúrgicamente, y se inserta un tubo o aguja a través de una incisión hecha entre los anillos traqueales. Complicaciones, tales como lesiones vasculares y fugas de aire, son posibles debido a la traqueotomía. b) Ruta endotraqueal: los siRNAs se rocian directamente desde la boca a los pulmones utilizando un aerolizador MicroSprayer ® (Penn-Century, Filadelfia, PA Es importante mantener una visión clara de la tráquea durante el procedimiento. El parto intranasal es otro método común de aplicación de fármacos pulmonares en estudios en animales. En muchos estudios, se ha demostrado éxito in vivo en la entrega de siRNAs a los pulmones intranasal [22, 35, 36 ]. Una configuración experimental de la entrega intranasal por pulverización o gotita es simple e indolora para el animal. Aunque el éxito en la entrega de siRNAs intranasal en roedores no puede ser completamente extrapolado al uso humano debido a las diferencias significativas en anatomía pulmonar [37], este enfoque tiene potencial para la aplicación clínica de siRNAs. Ensayos clínicos de fase II se han iniciado para el tratamiento de la infección por el virus sincitial respiratorio (RSV), haciendo uso de la aplicación intranasal de moléculas de siRNAs desnudas modificadas químicamente que se dirigen a los productos La entrada intranasal se ha utilizado durante mucho tiempo para administrar moléculas pequeñas, como proteínas, para el parto sistémico. Debido a que la mucosa nasal está altamente vascularizada, la entrega de un epitelio delgado de medicación a través de la superficie puede dar lugar a una rápida absorción del medicamento en la sangre. Por lo tanto, los siRNA administrados intranasalmente pueden depositarse en la nariz, y algunos de ellos pueden no poder llegar al tracto respiratorio inferior. De hecho, se ha informado que la aplicación intranasal de siRNAs no formulados dio lugar a una menor eficiencia de entrega y distribución pulmonar homogénea que la alcanzada con la aplicación intratraqueal [31]. El método intranasal es adecuado para algunas enfermedades pulmonares, como la infección respiratoria superior por VSR, y también tiene potencial para el parto sistémico en lugar de la entrega pulmonar de siRNAs. Por lo tanto, es importante considerar la vía de administración El uso de aerosoles para administrar medicamentos a los pulmones tiene un largo historial. La administración por inhalación es un método popular y no invasivo de administrar agentes a los pulmones. Hay varios dispositivos de inhalación disponibles para la entrega de medicamentos a los pulmones. Los inhaladores de dosis medidas (IDM) y los inhaladores de polvo seco (IDP) son los modos más comunes de administrar inhalación. Los inhaladores de dosis medidas son los inhaladores más utilizados para varias enfermedades pulmonares, como el asma, la bronquitis y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y un espaciador es un dispositivo externo que se une a una IDM para permitir una mejor administración de medicamentos mediante una mayor coordinación de la activación y la inhalación. Para la mayoría de los IDM, el propelente es uno o más gases llamados clorofluorocarbonos (CFC). Aunque los CFC en los medicamentos son seguros para que los pacientes inhalen, son perjudiciales para el medio ambiente. Por lo tanto, el desarrollo ulterior de los siRNA inhalables puede no ser la mejor manera de avanzar. Los DPI son dispositivos que entregan medicamentos a los pulmones en forma de polvo seco. El uso de los DPI ya ha demostrado ser prometedor para la entrega in vivo de macromoléculas terapéuticas como la insulina [39] y la heparina de bajo peso molecular [40] ; por lo tanto, podría ser un mejor dispositivo para la entrega de siRNAs a los pulmones. Las ventajas de los DPI son una mayor estabilidad y esterilidad de las biomoléculas sobre aerosoles líquidos y la formación libre de propelentes. Aunque los medicamentos se envían comúnmente a los pulmones por inhalación, la mayoría de los estudios in vivo que utilizan siRNAs se han basado en la entrega intratraqueal También se necesita un portador adecuado para proteger los ácidos nucleicos de la degradación debido a la fuerza de corte y al aumento de la temperatura durante el proceso de secado. Se ha demostrado el uso del secado por pulverización como técnica para la ingeniería de formulaciones en polvo seco de nanopartículas de siRNA, que podrían permitir la entrega local de siRNA biológicamente activo directamente al tejido pulmonar [24, 25]. En el futuro, la técnica es deseable para estimar el estudio in vivo sobre terapia de siRNA para inhalación. A largo plazo, anticipamos que habrá dispositivos más sofisticados para el uso clínico y que los que se están desarrollando serán más adecuados. Hay dos barreras principales para la entrega eficiente de siRNA pulmonar a las células del pulmón. La primera es la anatomía compleja y ramificada de los pulmones y barreras biomecánicas, como la capa de muco que cubre las células de las vías respiratorias [41, 42 La vía aérea consiste en bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y sacos alveolares. Todas estas estructuras contienen alvéolos, los diminutos sacos de aire en los que se produce el intercambio de gas. Generalmente se reconoce que el factor crítico para la entrega eficiente de siRNA depende de las propiedades de las partículas del fármaco ARNi en términos de tamaño, carga, forma, velocidad y densidad. Para la entrega eficiente de siRNA pulmonar, las partículas deben depositarse en el tracto respiratorio inferior. La deposición en la vía aérea se ve afectada por el tamaño de las partículas y la función pulmonar del paciente. Se encuentra que el tamaño de las partículas entre 1-5 μm es el más apropiado para la deposición en el tracto respiratorio inferior [23]. Además, la presencia de proteínas mucos y surfactantes, las acciones de aclaramiento mucociliar y la fagocitosis por Por lo tanto, los sistemas de parto generalmente requieren vectores de parto, y estos vectores necesitan ser diseñados con el fin de maximizar la deposición de siRNA en el área enferma del tracto respiratorio. Además, las barreras extracelulares al parto de siRNA también dependen de características fisiológicas del tracto respiratorio, que pueden cambiar con la enfermedad y características del paciente. En el estadio activo de la enfermedad pulmonar, las condiciones fisiológicas de las vías respiratorias podrían cambiar y tener un impacto significativo en la eficiencia del sistema de parto pulmonar. Durante la infección, inflamación y reacción alérgica, hay un aumento en la secreción de mucosidad junto con el aclaramiento mucociliar dañado [43]. Además, el asma y la EPOC son ambas condiciones inflamatorias crónicas del pulmón asociadas con "remodelación" estructural que no es apropiada para el mantenimiento de la función pulmonar normal [44]. Figura 2. Barreras extracelulares al parto de siRNA pulmonar. La característica anatómica del tracto respiratorio es su alto grado de ramificación. El moco alinea el epitelio respiratorio desde la cavidad nasal hasta los bronquios terminales. Las partículas depositadas en las células epiteliales ciliadas son rápidamente despejadas por las acciones de aclaramiento mucociliar. El muco y el aclaramiento mucociliar de las partículas atrapadas por mucosidad es un mecanismo de defensa pulmonar como barrera fisiológica. En las células alveolar, clara y alveolar tipo II se secretan en la superficie del epitelio alveolar, formando una capa delgada de surfactantes pulmonares. Los surfactantes actúan como barrera principal para el parto de siRNA porque reducen la eficiencia de la transfección. Además, los macrófagos ubicados en los alveolos absorbe Las partículas recogidas en los macrófagos se degradan posteriormente dentro de las células, los cuales presentan barreras importantes para el parto pulmonar dirigido; el segundo es el membrance de las células de las vías respiratorias y sus barreras intracelulares (Figura 3 ). Para el silenciamiento eficiente de los genes en los pulmones, los siRNAs deben ser entregados a su sitio de acción, ser estables, entrar en las células diana y estar presentes en el citoplasma a una concentración suficiente; una vez que los siRNAs alcanzan las células diana, deben ser transportados al citoplasma y llevados por Argonaute (Ago)2/complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que degrada los mRNAs y, posteriormente, suprime la expresión génica secuencia-específica; para que ocurra una endocitosis eficiente, las partículas deben tener un tamaño inferior a 150 nm. Las propiedades fisicoquímicas de los siRNA también juegan un papel significativo en el cruce de la membrana biológica. A pesar de su pequeño tamaño, la carga negativa y la degradabilidad química de las moléculas de siRNA les impiden cruzar fácilmente las membranas biológicas. Por lo tanto, los enfoques eficientes de siRNA necesitan superar esta limitación facilitando la captación celular. Una de las principales funciones de un vector de entrega es facilitar la captación celular de siRNA [46]. La complejación electrostática de moléculas de siRNA con lípidos y polímeros catiónicos ayuda a enmascarar su carga negativa neta. El complejo portador de siRNA con carga positiva interactúa con proteoglicanos aniónicos en la membrana celular, forma una vesícula endocítica, y entra en las células por endocitosis [47]. Después de la internalización celular, el complejo portador de siRNA en vesículas endocíticas es transportado a lo largo de microtúbulos a lisosomas que son colocalizados con el centro organizador de microtúbulos. Para evitar la degradación lisosómica, los siRNAs deben escapar del endosoma al citoplasma, donde pueden asociarse con la maquinaria ARNi. El escape endosomal es una barrera importante para la entrega eficiente de siRNA [48, 49]. El endosomal atrapamiento y la degradación lisosómica del siRNA y los portadores contribuyen a la baja eficiencia de transfección y es una dificultad importante para los vectores de entrega. Un agente de entrega ideal debe proteger los siRNAs de la degradación enzimática, facilitar la absorción celular, y promover la fuga endosomal dentro de las células con toxicidad insignificante. Se han reportado múltiples enfoques para la entrega de siRNAs, que van desde la administración directa relativamente simple de siRNAs con forma salina hasta enfoques de nanopartículas basadas en lípidos y polímeros y enfoques de conjugación y complejación de siRNAs [50]. La carga negativa y la degradabilidad química de los siRNAs bajo condiciones fisiológicamente relevantes hacen que su entrega sea un desafío importante. En consecuencia, la entrega de siRNAs generalmente requiere un vector o portadores para su transfección en las células diana. En general, se están evaluando vectores virales y no virales para la entrega de siRNAs a las células pulmonares. Algunos vectores virales, como retrovirus y adenovirus, han sido demostrados para mediar el silenciamiento genético en un modelo pulmonar in vitro [51] e inducir RNAi en una gama de tejidos animales [52]. El siRNA mediado por lentivirus fue utilizado específicamente para derribar la expresión de la proteína nuclear 1 (NUPR1) in vivo, lo que resultó en un crecimiento tumoral inhibido [53]. Sin embargo, el parto basado en virus tiene varias desventajas. La respuesta inmune a los virus no sólo impide la entrega de genes sino que también tiene el potencial de causar complicaciones graves [54]. Casos recientes bien documentados, como la muerte de Jesse Gelsinger debido a complicaciones relacionadas con un vector de distribución adenoviral, destacan este problema [55]. Además, algunos vectores virales pueden insertar su genoma en posiciones aleatorias en el cromosoma huésped, lo que finalmente restringe la función génica [56].. Barreras intracelulares al suministro de siRNA pulmonar. Las barreras a la internalización celular dependen de las propiedades superficiales del siRNA y los portadores (por ejemplo, carga y tamaño). Después de que los siRNAs sean llevados exitosamente a las células diana por medio de endocitosis, las principales barreras para entregar siRNAs a su sitio de acción son la atrapación endosomal y la degradación lisosómica del siRNAs y los portadores. Para dirigir el silenciamiento del gen diana, los siRNAs necesitan escapar del endosoma hacia el citoplasma, donde se asocian con el complejo silenciador inducido por Ago2/ARN (RISC) para dirigir la división de mRNAs con sitios de unión complementarios. Como alternativa a los vectores virales, los vectores no virales, incluyendo vectores basados en lípidos y polímeros, generalmente se han utilizado para la entrega de siRNAs a los pulmones debido a su toxicidad reducida [57]. Los vectores de entrega basados en lípidos se utilizan con éxito para producir siRNA in vitro e in vivo [58]. Los lípidos catiónicos están compuestos de cabeza cargada positivamente, un enlace e hidrofóbico. En general, los complejos basados en lípidos son fáciles de formular y se logra una buena eficacia de transfección debido a la interacción con la membrana celular cargada negativa. Muchos agentes de transfección de siRNA comerciales son sistemas de administración basados en lípidos, algunos de los cuales también se emplean para el parto pulmonar-DharmFECT [30], Oligofectamina [59], Lipofectamina [60] y TransIT-TKO [35]. Del mismo modo, los polímeros catiónicos también se han evaluado para la entrega de siRNA a las células pulmonares. Por otro lado, los vectores basados en lípidos también pueden inducir toxicidad y activación inespecífica de las respuestas inflamatorias de citocina e interferón [62, 63]. Aunque los vectores basados en polímero provocan una respuesta inmune relativamente menos fuerte que los vectores basados en lípidos, la administración efectiva de siRNA a un área local en enfermedades pulmonares requiere más atención al desarrollo de vectores de entrega no tóxicos. Un punto importante para la inhibición de la expresión génica mediada por siRNA es si los efectos observados son específicos y no debidos a efectos fuera de la meta y no están libres de respuestas potenciales de interferón [64, 65]. Curiosamente, algunos estudios han demostrado que fue posible administrar "siRNA desnuda" a ratones y regular un objetivo endógeno o exógeno sin inducir una respuesta de interferón [66]. Los siRNAs desnudos son degradados por las endonucleasas séricas y generalmente son eliminados por filtración glomerular, resultando en una corta semivida plasmática de < 10 min. Por lo tanto, algunos estudios de la entrega sistémica de siRNAs desnudos no han logrado reducir la regulación del gen objetivo [67, 68]. En contraste, también ha habido algunos éxitos en la entrega local de siRNAs desnudos a los pulmones [15, 16, 20, 31]. Algunos de ellos reportaron que el uso de vectores de distribución no mostró diferencia significativa en la eficiencia silenciadora de genes en comparación con la de los siRNAs desnudos [16, 35]. De hecho, en un ensayo clínico, se ha utilizado la entrega de siRNAs desnudos para el tratamiento de RSV [17, 38]. Esta evidencia exitosa puede ser debido a que los siRNAs desnudos para aplicaciones clínicas son altamente modificados químicamente para prevenir la degradación inducida por nucleasa y presumiblemente minimizar los efectos estimuladores inmunes. Aunque no está claro cómo los siRNAs desnudos cruzan la membrana celular, obtienen acceso al citoplasma y permanecen intactos para realizar su acción biológica, tanto los ensayos en animales como en humanos se han llevado a cabo exitosamente, mostrando la eficacia de los siRNAs desnudos (ALN-RSV01) que fueron administrados intranasalmente. Esta explicación no ha sido confirmada, pero el daño fisiológico de las células epiteliales respiratorias causadas por infección viral puede posiblemente haber influido en el misterio. El cambio activo en la membrana celular epitelial de la vía aérea causada por enfermedad infecciosa podría afectar la internalización celular. Sin embargo, la ventaja de los siRNA desnudos sobre los vectores de parto en el tratamiento de enfermedades pulmonares es controvertida [69, 70]. Se requieren más investigaciones in vivo sobre los siRNA desnudos y los vectores no virales. La enfermedad pulmonar es una de las principales causas de muerte, y la disminución de la calidad de vida es responsable del sufrimiento de muchos pacientes. Varias enfermedades pulmonares hacen la vida extremadamente difícil para los pacientes, y los casos graves de estas enfermedades pulmonares pueden resultar en la muerte. Las altas tasas de muerte asociadas con el cáncer de pulmón se deben en parte al hecho de que es lamentablemente difícil de curar. Sobre todo, la EPOC es la cuarta causa de muerte en la mayoría de los países industrializados y se prevé que se convierta en tercera para 2020 [71]. Por lo tanto, se necesita una acción decisiva para frenar el aumento de la salud y la carga económica que esto representa. Las enfermedades pulmonares crónicas La aprobación de corticosteroides inhalados fue pionera en una nueva generación de terapia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, siendo la primera vez que se disponía de un producto antiinflamatorio para reducir la inflamación pulmonar característica en las vías respiratorias y la obstrucción asociada. Los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica. Sin embargo, se utilizan con limitaciones en la EPOC y asma de moderada a grave. Asimismo, el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares refractarias también depende de la terapia sistémica con corticosteroides. Muchos de estos pacientes también sufrieron diversos efectos secundarios del uso sistémico de corticosteroides, como aumento de peso e hiperglucemia no controlada. El tratamiento de la enfermedad pulmonar utilizando una orientación celular específica, así como técnicas RNAi, representan una estrategia novedosa y podrían proporcionar nuevas oportunidades en nanomedicina. Las aplicaciones pulmonares de siRNA in vivo son frecuentemente estudiadas y a menudo resultan en ensayos clínicos [57, 72]. Desde el descubrimiento de ARNi, el potencial terapéutico de los siRNAs ha sido rápidamente reconocido. En 2004, el primer ensayo clínico humano de terapia basada en ARNi se inició para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad con un siRNA dirigido al receptor de VEGF 1 entregado intravítreamente [73]. Se han realizado muchos estudios en los últimos años que involucran la entrega de siRNAs a los pulmones para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. La entrega a los pulmones será más importante para mover la tecnología de siRNAs a la clínica. Se están evaluando varias terapias basadas en siRNAs en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes condiciones, incluyendo enfermedades pulmonares como asma e infección por VSR. La Tabla 1 es un resumen de ensayos clínicos de terapias basadas en siRNAs [74]. El siRNA muestra potencial para el tratamiento de varias infecciones virales pulmonares, y se ha reportado que los tratamientos basados en el siRNA también pueden ser utilizados en el tratamiento de la gripe [13], el virus de la parainfluenza [35], el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) [14], y el VRS [35]. Sobre todo, el VRS es el objetivo terapéutico más prometedor de los siRNAs. El VRS es una causa común de infecciones respiratorias graves en lactantes y niños. También produce morbilidad y mortalidad significativas en poblaciones adultas inmunocomprometidas o ancianas [75]. No se dispone de una vacuna contra el VRS, y la única terapia antiviral aprobada para el VRS es indeseable para los pacientes pediátricos debido a su potencial teratogenicidad y eficacia limitada. El tratamiento basado en ARNi ha mostrado efectos prometedores en modelos murinos de infección por VRS [35]. El siRNA, ALN-RSV01, está dirigido contra el ARNm que codifica la proteína N del VRS que exhibe actividad anti-VRS específica in vitro e in vivo. Se entrega sin un vector de parto como aerosol nasal y se dirige al tracto respiratorio superior en lugar del área pulmonar inferior. ALN-RSV01 ha sido sometido a estudios completos de fase I intranasal e inhalación en adultos sanos y se ha encontrado que es generalmente bien tolerado [38]. Además, ALN-RSV01 ha sido evaluado en un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en pacientes trasplantados de pulmón con infección del tracto respiratorio RSV [76]. La administración de ALN-RSV01 a pacientes de trasplante de pulmón infectados por VRS fue segura y bien tolerada y asociada con una Basándose en estos resultados, se ha iniciado un ensayo multinacional más amplio, aleatorizado y doble ciego de fase IIb de ALN-RSV01 en pacientes con trasplante de pulmón para confirmar y extender estos hallazgos. El cáncer es un objetivo principal de la terapia basada en ARNi, ya que los oncogenes, los genes supresores de tumores mutados y varios otros genes que contribuyen a la progresión del tumor son objetivos potencialmente importantes para el silenciamiento de genes por ARNi. El cáncer de pulmón es uno de los tumores más frecuentes en todo el mundo con respecto a las tasas de incidencia y mortalidad. Los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican comúnmente en un estadio avanzado de la enfermedad y tienen opciones terapéuticas limitadas. La principal ventaja de la terapia ARNi en el cáncer podría ser la focalización simultánea de genes múltiples pertenecientes a diferentes vías celulares que participan en la progresión del tumor. La inhibición simultánea de varios genes también minimizaría el riesgo de resistencia a fármacos que normalmente se encuentran con terapias basadas en pequeñas moléculas, que involucran siRNAs y miRNAs. Ya ha habido mejoras significativas en los siRNAs para el tratamiento primario o metastásico del cáncer de pulmón al dirigirse a oncogenes como Akt1 [9], tumor de Wilms 1 (WT1) [12], genes sobreexpresados como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) [77], NUPR1 [53] y EZH2 [78]. Algunos de estos estudios han demostrado con éxito la eficacia de la terapia basada en ARNi mediante la administración intrapulmonar de siRNAs Aunque se deben diseñar estrategias para minimizar los efectos inmunoestimuladores fuera de objetivo y no específicos, estos datos sugieren que el silenciamiento del gen diana con siRNAs es una estrategia atractiva para la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón primario y metastásico. Actualmente hay algunos ensayos clínicos en curso que estiman la seguridad y eficacia de los fármacos basados en siRNAs para el tratamiento del cáncer. Atu027, un siRNA-lipoplex dirigido contra la proteína cinasa N3 (PKN3), previno la metástasis pulmonar en un ensayo de fase I de varios modelos de cáncer [79]. PKN3 es un efector aguas abajo de la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), que regula diversas respuestas celulares, incluyendo desarrollo, crecimiento y supervivencia [81]. Recientemente, PKN3 también ha sido considerado como una diana terapéutica adecuada para modular la angiogénesis tumoral debido a que la pérdida de análisis de función con Atu027 en células endoteliales primarias cultivadas mostró un papel esencial de PKN3 para la formación y migración de tubos endoteliales [79]. Atu027 puede ser considerado como un potencial siRNA para prevenir metástasis pulmonares y podría ser adecuado para prevenir metástasis hematógenas combinadas con terapia convencional del cáncer. La enfermedad pulmonar inflamatoria, también llamada EPOC, incluye una amplia gama de dolencias pulmonares. Estas enfermedades relacionadas incluyen asma, fibrosis pulmonar y bronquitis crónica. Están influenciadas por una combinación de componentes ambientales, genéticos y epigenéticos [82]. La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. La EPOC se asocia principalmente al tabaquismo, y estudios recientes que investigan la fisiopatología del enfisema han demostrado que el humo del cigarrillo puede causar que las células entren en la senescencia celular. Fumar puede causar senescencia a las células debido al daño del ADN a través del aumento del recambio celular, lo que a su vez conduce al acortamiento acelerado del telómero [84]. Últimamente, muchos estudios han investigado el papel de la senescencia celular en el desarrollo y la progresión de la EPOC [85]. Aunque varias clases de medicamentos, incluyendo corticosteroides inhalados, se utilizan para el tratamiento de la EPOC, ninguno de estos medicamentos ha demostrado mejorar significativamente la función pulmonar a largo plazo durante la progresión de la enfermedad. Muchas personas están desarrollando EPOC, y la causa de esta afección es complicada y no se comprende a fondo.Un factor clave es la susceptibilidad genética.Algunos estudios han mostrado una gran contribución genética a la variabilidad de la función pulmonar y EPOC [86, 87].Los polimorfismos en genes múltiples se han reportado asociados con EPOC [87], tales como factor de transcripción [por ejemplo factor nuclear-kappa B (NFoB)] [88], matriz extracelular (por ejemplo, matriz metaloproteinasa-12 (MMP-12)) [89, 90], citocinas [por ejemplo factor de necrosis tumoral (TNF)-α] [91], quimioquinas [por ejemplo. la interleucina (IL)-8, el receptor IL-8 y el receptor de quimiocina (CCR)1 [92, 93], y la apoptosis (por ejemplo, caspasa-3 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) [94, 95]. Muchos de ellos se han identificado como posibles blancos de la intervención terapéutica utilizando inhibidores de moléculas o antagonistas. Aunque varios tratamientos nuevos que se dirigen al proceso inflamatorio se encuentran ahora en desarrollo clínico, como inhibidores del TNF-α e inhibidores del complejo I-kappaB cinasa 2 (IKK2) [96, 97], los ensayos clínicos con siRNA nunca se han realizado en la EPOC. El retraso en el desarrollo de fármacos para la EPOC podría deberse a la aparición relativamente reciente de investigaciones que abordan la base molecular de la EPOC. Además, se necesitan más investigaciones para entender los mecanismos moleculares esenciales sobre la patogénesis de la EPOC y desarrollar técnicas de monitoreo para apoyar el desarrollo de terapias ARNi. Actualmente, no hay tratamientos disponibles que reduzcan la progresión de la EPOC o supriman la inflamación en las vías aéreas pequeñas y el parénquima pulmonar. El enfoque basado en los ARNi para las moléculas clave también tiene implicaciones potenciales para el tratamiento de la EPOC. El asma es también una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas caracterizada por síntomas variables y recurrentes y obstrucción reversible del flujo de aire. La Organización Mundial de la Salud estima que actualmente están afectadas 300 millones de personas y que, para el año 2025, otros 100 millones serán afectados por la enfermedad [98]. Los corticosteroides inhalados son muy eficaces en asma leve porque mejoran los síntomas y disminuyen las exacerbaciones. Aunque los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica para las enfermedades pulmonares inflamatorias, su uso no siempre es completamente efectivo y está asociado con efectos secundarios. Debido a estas limitaciones, está claro que hay una necesidad de nuevos tipos de medicamentos que pueden tratar y mejorar el pronóstico de asma moderada a grave. Se han identificado muchos genes diana que participan en la patogénesis del asma. Los objetivos más prometedores incluyen la codificación de genes para citoquinas (IL-4, IL5, IL-13), receptores de citoquinas y quimioquinas (IL-4 y CCR3), y tirosina quinasas [tirosina quinasa batida (Syk) y nuevas tirosina quinasa (Lyn) relacionadas con LCK/YES)], así como para factores de transcripción [transductores de señales y activadores de transcripción 1 (STAT1), STAT6, GATA3 y NF Actualmente, en un ensayo clínico para el asma, Excellair TM (ZaBeCor, Bala Cynwyd, PA, EE.UU.), se está utilizando un siRNA que se dirige a Syk. La cinasa está involucrada en la señalización de un receptor de células B y es un regulador clave de cascadas de señalización aguas abajo que en última instancia conducen a la activación de varios factores de transcripción proinflamatorios. Se ha reportado que los oligonucleótidos antisensibles administrados por aerosol fueron potentes para disminuir la expresión de Syk, liberación mediadora de macrófagos alveolares e inflamación pulmonar dependiente de Syk [102]. Además, se ha demostrado la inhibición de mediadores inflamatorios en un estudio utilizando siRNA dirigido a Syk en células epiteliales de vía aérea [103]. Algunos de los tratamientos actuales para el asma y otras condiciones inflamatorias, tales como inhibidores del TNF-α o inhibidores del leucotrieno, inhiben sólo uno de los mediadores de la inflamación. En contraste, el siRNA dirigido Syk busca inhibir un paso inicial de señalización de la inflamación y, por lo tanto, evitar la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. En general, el progreso reciente de los siRNAs a los pulmones también ha mejorado la viabilidad terapéutica de los ARNi para enfermedades pulmonares inflamatorias. El progreso rápido pondrá los tratamientos basados en el siRNA en una vía rápida a la clínica. MiRNAs son pequeños ARNs no codificantes endógenos que regulan la expresión génica reprimiendo la traducción o promoviendo la degradación de su mRNA objetivo. MiRNAs regulan la expresión génica mediante la unión a la 3′ región no traducida (UTR) de En el genoma humano, se estima que las transcripciones de aproximadamente el 60% de todos los ARNm están dirigidas por los miRNAs [104]. De acuerdo con su función, los miRNAs desempeñan un papel importante en los procesos celulares como desarrollo, proliferación y apoptosis de patologías pulmonares [105]. Se ha demostrado que un número creciente de miRNAs están involucrados en diferentes enfermedades pulmonares. Esta evidencia hace de los miRNAs una tecnología prometedora para el desarrollo terapéutico actual y futuro. Discutimos el papel de algunos miRNAs en diversas enfermedades pulmonares, así como el posible futuro de estos descubrimientos en aplicaciones clínicas.La Tabla 2 muestra el resumen de los miRNAs en el desarrollo terapéutico.En este punto, una terapia basada en miRNAs ya ha entrado en un ensayo clínico de fase II.Existe evidencia de que la regulación ascendente o descendente de los miRNAs es Muchos estudios se han centrado en el papel de los miRNAs en las enfermedades pulmonares inflamatorias, como la EPOC [116, 117], la fibrosis pulmonar [118] [118] [119] [129] y el asma [122] [123] [123] [125] [125] (Tabla 3). [130] [117, 129] La patogénesis de la EPOC se atribuye no sólo a la inflamación crónica en las vías respiratorias sino también a la inflamación sistémica [131]. El tabaquismo es el principal factor de riesgo para el desarrollo de la EPOC. Se ha demostrado que el tabaquismo causa cambios biológicos en la expresión génica de los pulmones [132], y hay algunos informes sobre los miRNAs relacionados con el tabaquismo [117, 129, 130]. Sin embargo, hay pocos informes que se centran en los miRNAs relacionados con la patogénesis de esta enfermedad con componentes inflamatorios sistémico El estudio reciente sobre fibroblastos pulmonares de pacientes con EPOC presenta menos expresión de miR-146a después de la estimulación con citocinas proinflamatorias en comparación con sujetos no EPOC con historias de tabaquismo similares [127]. La regulación descendente de miR-146a resultó en una vida media prolongada de ciclooxigenasa-2 del ARNm, aumentando así la prostaglandina E2 en fibroblastos de sujetos con EPOC. Además, Ezzie et al. investigaron la diferencia de perfiles de miRNA expresados en los pulmones de fumadores con y sin EPOC. Concluyeron que miR-223 y miR-1274a fueron los miRNA más afectados en sujetos con EPOC [126]. Sin embargo, la EPOC es un trastorno complejo, multicomponente y heterogéneo con una serie de diferentes procesos patológicos y subgrupos con sus propias características Se necesita una mejor comprensión de la complejidad de la enfermedad y de la potencial relevancia clínica de los miRNA identificados. La fibrosis pulmonar puede ser causada por una irritación identificable a los pulmones, pero en muchos casos se desconoce la causa, y las posibilidades terapéuticas son limitadas. El tabaquismo es uno de los factores de riesgo más reconocidos para el desarrollo de fibrosis pulmonar. Este trastorno se acompaña principalmente de una mayor expresión del mediador fibrótico clave que transforma el factor de crecimiento β (TGF-β) y otras citoquinas producidas en la lesión de fibrosis activa [128]. Recientemente, se informó que los miRNAs pueden desempeñar un papel regulador importante en el cambio fibromático pulmonar en los pulmones. La regulación descendente de let-7d en fibrosis pulmonar idiopática (IPF) resultó en un aumento de la deposición de colágeno y engrosamiento septal alveolar [119] En un modelo diferente de ratón asmático, se observó un aumento en la expresión de miR-21 en los pulmones [123]. Este informe podría contribuir a la comprensión del mecanismo inflamatorio en la vía aérea a través de la inhibición de IL-12, favoreciendo la respuesta de linfocitos Th2. Un receptor 4 (TLR4) inducido por Th2 induce una alta expresión de miR-126, y el bloqueo selectivo de miR-126 suprimió el fenotipo asmático [124]. Además, la remodelación de la vía aérea es una característica del asma y tiene importantes implicaciones funcionales. Rodríguez et al. han demostrado que miR-155 está relacionada con el desarrollo de infiltración inflamatoria en el pulmón y la remodelación de la vía aérea [122]. Así, algunos estudios presentan una conexión funcional entre la expresión de miRNA y la patogénesis del asma y sugieren que dirigir miRNA en las vías respiratorias puede conducir a tratamientos antiinflamatorios para el asma alérgica. A pesar de la evidencia de modelos experimentales, el perfil de expresión de miRNAs en biopsias de vías respiratorias de pacientes con asma leve antes y después del tratamiento con corticosteroides inhalados y en voluntarios sanos no reveló diferencias en la expresión de miRNAs [135]. Se requieren investigaciones adicionales sobre el papel de los miRNAs relacionados con la patogénesis del asma. Aunque la evidencia básica de la biología de miRNAs sigue proporcionando nuevas ideas, las aplicaciones de la terapia basada en miRNAs para enfermedades pulmonares inflamatorias son menos avanzadas que las del cáncer de pulmón [136]. Una razón de esto podría ser que la heterogeneidad de la enfermedad es causada por los efectos de muchos contaminantes ambientales del aire, incluyendo humo y compuestos orgánicos volátiles. La presencia de varios factores de riesgo complica la comprensión de la patogénesis de enfermedades pulmonares inflamatorias. La comprensión del papel que desempeñan los miRNAs en la modulación de la expresión génica, que conduce a sostener la patogénesis de las enfermedades pulmonares, es importante para el desarrollo de nuevas terapias que se centran en la prevención de la progresión de la enfermedad y el alivio de los síntomas. Dadas las importantes funciones que desempeñan los miRNAs en múltiples vías de carcinogénesis pulmonar, se están dedicando cada vez más esfuerzos a la investigación y desarrollo de terapias basadas en miRNAs, incluyendo la restauración de las funciones de miRNAs supresoras de tumores o la inhibición de miRNAs oncogénicos. El desarrollo de terapias basadas en miRNAs para el cáncer de pulmón está creciendo prósperamente con la ayuda de nuevas tecnologías ARNi. En comparación con las terapias basadas en siRNAs, que ya están en ensayos clínicos, los miRNAs son menos tóxicos y tienen el potencial de Los problemas críticos para el desarrollo de esta terapia son la entrega efectiva a los sitios de destino, la potencia de la terapia y la eliminación de los efectos fuera de la diana [137]. Hay dos estrategias como las aplicaciones terapéuticas de los miRNAs para el cáncer de pulmón [138]. Una estrategia es la terapia de reemplazo de miRNAs, que implica la reintroducción de un miRNA supresor tumoral imitado para restaurar una pérdida de la función. MiRNAs imitan a los duplex de ARN sintéticos diseñados para imitar las funciones endógenas de los miRNAs con modificaciones químicas para la estabilidad y la absorción celular. El concepto de terapia de reemplazo de miRNAs es más ejemplificado por el miRNAs let-7. let-7 es un miRNAs tumor-supresor en cáncer de pulmón no microcítico que se correlaciona inversamente con la expresión La administración intranasal de let-7 imitado en modelos de ratón de cáncer de pulmón redujo significativamente el crecimiento del tumor, lo que sugiere que la terapia de reemplazo de miRNA es realmente prometedora [106, 140, 141]. Otro miRNA que muestra el valor del reemplazo de miRNA es proporcionado por miR-34a [107, 142]. La administración local y/o sistémica de una miR-34a sintética imitada llevó a la acumulación de miR-34a en el tejido tumoral e inhibición del crecimiento del tumor pulmonar. Últimamente, Ling et al. también mostraron que el supresor miR-22 mostró actividad anti-cáncer pulmonar mediante la regulación post-transcripción de ErbB3 [143]. Así, las miRNA terapéuticas imitadas tienen un potencial poderoso atacando genes múltiples relevantes para varias enfermedades. Sin embargo, es necesario prestar atención a la toxicidad potencial en los tejidos normales en condiciones en las que la administración terapéutica de miRNA imita conducirá a una acumulación de miRNAs exógenos en células normales [138]. Aunque las suposiciones están bien fundadas, todavía hay evidencia insuficiente de toxicidad causada por miRNA imitaciones. De hecho, varios estudios in vivo fallaron en revelar efectos secundarios causados por los miRNA imitaciones y sugirió que la entrega de miRNA imitaciones a tejidos normales fue bien tolerada [107, 141]. Será importante investigar los efectos miRNAs imitados en células normales y evaluar cuidadosamente la toxicidad antes de utilizarlos en la práctica clínica. La segunda estrategia se dirige a una ganancia de función y tiene como objetivo inhibir oncomiRs mediante el uso de anti-miRNAs. Las modificaciones químicas, como el grupo 2'-O-metilo y el ácido nucleico bloqueado (LNA), aumentarían la estabilidad del oligo contra las nucleasas [144]. Los oligonucleótidos antisensibles contenidos en estas modificaciones se denominan antagomirs o "LNA-antimiRs" [144, 145]. Son oligonucleótidos con secuencias complementarias al miRNA endógeno e inhiben la función específica del miRNA. Se ha demostrado que un LNA-antimiR contra miR-122 silencia efectivamente miR-122 en primates no humanos [145], y los hallazgos apoyan el potencial de estos compuestos como una nueva clase terapéutica. Además, también se ha reportado que los anti-miR-150 suministrados en el tumor pulmonar xenoinjertos en ratones llevaron a un crecimiento tumoral inhibido En relación con estudios sobre miRNA imitados, estudios con oligonucleótidos antisensibles han mostrado evidencia efectiva con oligonucleótidos desnudos, lo que ilustra el potencial de modificaciones químicas de oligonucleótidos para mejorar su estabilidad, resistencia a la RNASa y propiedades farmacológicas, por lo que la inhibición de la función miRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificados se ha convertido en un enfoque importante y ampliamente utilizado. Datos recientes del primer estudio de fase II en pacientes con infección crónica por VHC tratados con el antimiR-122 modificado por LNA mostraron que este compuesto fue bien tolerado y proporcionó supresión viral continua. Un número creciente de estudios han examinado el potencial terapéutico de los miRNAs. Recientemente, ha surgido la evidencia de roles para miRNAs en la determinación de resistencia a fármacos [147]. En esta situación, la combinación de miRNA imita o antimiR con quimioterapia puede potenciar la eficacia del tratamiento del cáncer en el futuro. Además, los miRNA relacionados con las células madre cancerosas pueden ampliar significativamente el campo de la terapia basada en miRNA y sugerir que los miRNAs pueden ser herramientas potenciales para destruir las células cancerosas asociadas con la resistencia a la terapia, recurrencia y metástasis [108, 148]. Por lo tanto, el principal desafío es el suministro exitoso y las modificaciones químicas de los miRNAs terapéuticos al tejido objetivo sin dañar los tejidos normales. Los enfoques basados en ARNi proporcionan una modalidad terapéutica prometedora para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. Uno de los mayores desafíos en la terapia basada en ARNi sigue siendo el método de entrega de los siRNAs terapéuticos y miRNAs a las células objetivo. Las aplicaciones de parto pulmonar son muy atractivas, ya que tienden a ser no invasivas, son localmente restringidas y pueden ser administradas por el paciente. Una intervención terapéutica realista, como la aerosolización, puede mejorar la administración de medicamentos en el lugar de acción y disminuir la exposición sistémica del paciente a la terapia, reduciendo así los efectos fuera de la diana. El avance de la entrega de siRNA pulmonar a la clínica ilustra que la terapia basada en ARNi ocupa un lugar central en el tratamiento futuro de las enfermedades pulmonares. Por otro lado, los miRNAs tienen la oportunidad de dirigir genes múltiples de una manera refinada, y la terapia basada en miRNA proporcionará un atractivo enfoque antitumoral y antiinflamatorio para diversas enfermedades pulmonares. En particular, la terapia antimiRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificado se ha convertido en una terapia potencial para enfermedades pulmonares porque los oligonucleótidos El aumento de la evidencia ha indicado que los miRNA cumplen funciones causales en una variedad de enfermedades pulmonares y han impulsado investigaciones sobre su potencial como dianas terapéuticas. Para el desarrollo futuro se requieren una mayor comprensión de los mecanismos detallados de la terapia basada en ARNi y la investigación de métodos de parto más eficaces. Estos nuevos enfoques podrían abrir nuevas vías para diversas enfermedades pulmonares y mejorar el resultado clínico de los pacientes.
|
¿Qué estructuras forman la vía aérea humana?
| false
| 1,619
|
{
"text": [
"respiratory bronchioles, alveolar ducts, and alveolar sacs"
],
"answer_start": [
6995
]
}
|
bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y sacos alveolares
|
641
|
Las plataformas terapéuticas de RNAi para las enfermedades pulmonareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816685/Fujita, Yu; Takeshita, Fumitaka; Kuwano, Kazuyoshi; Ochiya, Takahiro2013-02-06DOI:10.3390/ph6020223Licencia:cc-byAbstract: La interferencia del ARN (ARNi) se está convirtiendo rápidamente en un método importante para analizar las funciones genéticas en muchos eucariotas y promete el desarrollo de silenciamiento genético terapéutico. La inducción de RNAi se basa en los pequeños ARN silenciadores, que afectan a la degradación específica del ARN mensajero (ARNm). Los estudios de descubrimiento de fármacos y los tratamientos novedosos de los siRNAs están actualmente dirigidos a una amplia gama de enfermedades, incluyendo varias infecciones virales y cánceres. Las enfermedades pulmonares en general son blancos atractivos para las terapias de siRNAs debido a su letalidad y prevalencia. Además, el pulmón es accesible anatómicamente a los agentes terapéuticos a través de la vía intrapulmonar. Recientemente, la evidencia creciente indica que los miRNAs desempeñan un papel importante en las anomalías pulmonares, como la inflamación y la oncogénesis. Por lo tanto, los miRNAs están siendo dirigidos con fines terapéuticos. En esta revisión, presentamos estrategias para el parto de ARNi y discutimos el estado actual de la técnica RNAi basada en el arte para diversas enfermedades pulmonares. Texto: cirugía tradicional, Bivas-Benita et al. reportaron que no se produjo mortalidad como resultado del uso de Las aplicaciones endotraqueales están siendo utilizadas actualmente por muchos profesionales en el campo pulmonar [22, 34] ; esto es útil para estudiar la administración de fármacos pulmonares en ratones. Sin embargo, el enfoque es más complejo en humanos porque se utiliza una vía artificial para la entrega de medicamentos en los pulmones. Por lo tanto, el método se está utilizando en modelos animales para probar y evaluar su fiabilidad para posibles aplicaciones clínicas. Ruta intraqueal: bajo anestesia, la tráquea se expone quirúrgicamente, y se inserta un tubo o aguja a través de una incisión hecha entre los anillos traqueales. Complicaciones, tales como lesiones vasculares y fugas de aire, son posibles debido a la traqueotomía. b) Ruta endotraqueal: los siRNAs se rocian directamente desde la boca a los pulmones utilizando un aerolizador MicroSprayer ® (Penn-Century, Filadelfia, PA Es importante mantener una visión clara de la tráquea durante el procedimiento. El parto intranasal es otro método común de aplicación de fármacos pulmonares en estudios en animales. En muchos estudios, se ha demostrado éxito in vivo en la entrega de siRNAs a los pulmones intranasal [22, 35, 36 ]. Una configuración experimental de la entrega intranasal por pulverización o gotita es simple e indolora para el animal. Aunque el éxito en la entrega de siRNAs intranasal en roedores no puede ser completamente extrapolado al uso humano debido a las diferencias significativas en anatomía pulmonar [37], este enfoque tiene potencial para la aplicación clínica de siRNAs. Ensayos clínicos de fase II se han iniciado para el tratamiento de la infección por el virus sincitial respiratorio (RSV), haciendo uso de la aplicación intranasal de moléculas de siRNAs desnudas modificadas químicamente que se dirigen a los productos La entrada intranasal se ha utilizado durante mucho tiempo para administrar moléculas pequeñas, como proteínas, para el parto sistémico. Debido a que la mucosa nasal está altamente vascularizada, la entrega de un epitelio delgado de medicación a través de la superficie puede dar lugar a una rápida absorción del medicamento en la sangre. Por lo tanto, los siRNA administrados intranasalmente pueden depositarse en la nariz, y algunos de ellos pueden no poder llegar al tracto respiratorio inferior. De hecho, se ha informado que la aplicación intranasal de siRNAs no formulados dio lugar a una menor eficiencia de entrega y distribución pulmonar homogénea que la alcanzada con la aplicación intratraqueal [31]. El método intranasal es adecuado para algunas enfermedades pulmonares, como la infección respiratoria superior por VSR, y también tiene potencial para el parto sistémico en lugar de la entrega pulmonar de siRNAs. Por lo tanto, es importante considerar la vía de administración El uso de aerosoles para administrar medicamentos a los pulmones tiene un largo historial. La administración por inhalación es un método popular y no invasivo de administrar agentes a los pulmones. Hay varios dispositivos de inhalación disponibles para la entrega de medicamentos a los pulmones. Los inhaladores de dosis medidas (IDM) y los inhaladores de polvo seco (IDP) son los modos más comunes de administrar inhalación. Los inhaladores de dosis medidas son los inhaladores más utilizados para varias enfermedades pulmonares, como el asma, la bronquitis y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y un espaciador es un dispositivo externo que se une a una IDM para permitir una mejor administración de medicamentos mediante una mayor coordinación de la activación y la inhalación. Para la mayoría de los IDM, el propelente es uno o más gases llamados clorofluorocarbonos (CFC). Aunque los CFC en los medicamentos son seguros para que los pacientes inhalen, son perjudiciales para el medio ambiente. Por lo tanto, el desarrollo ulterior de los siRNA inhalables puede no ser la mejor manera de avanzar. Los DPI son dispositivos que entregan medicamentos a los pulmones en forma de polvo seco. El uso de los DPI ya ha demostrado ser prometedor para la entrega in vivo de macromoléculas terapéuticas como la insulina [39] y la heparina de bajo peso molecular [40] ; por lo tanto, podría ser un mejor dispositivo para la entrega de siRNAs a los pulmones. Las ventajas de los DPI son una mayor estabilidad y esterilidad de las biomoléculas sobre aerosoles líquidos y la formación libre de propelentes. Aunque los medicamentos se envían comúnmente a los pulmones por inhalación, la mayoría de los estudios in vivo que utilizan siRNAs se han basado en la entrega intratraqueal También se necesita un portador adecuado para proteger los ácidos nucleicos de la degradación debido a la fuerza de corte y al aumento de la temperatura durante el proceso de secado. Se ha demostrado el uso del secado por pulverización como técnica para la ingeniería de formulaciones en polvo seco de nanopartículas de siRNA, que podrían permitir la entrega local de siRNA biológicamente activo directamente al tejido pulmonar [24, 25]. En el futuro, la técnica es deseable para estimar el estudio in vivo sobre terapia de siRNA para inhalación. A largo plazo, anticipamos que habrá dispositivos más sofisticados para el uso clínico y que los que se están desarrollando serán más adecuados. Hay dos barreras principales para la entrega eficiente de siRNA pulmonar a las células del pulmón. La primera es la anatomía compleja y ramificada de los pulmones y barreras biomecánicas, como la capa de muco que cubre las células de las vías respiratorias [41, 42 La vía aérea consiste en bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y sacos alveolares. Todas estas estructuras contienen alvéolos, los diminutos sacos de aire en los que se produce el intercambio de gas. Generalmente se reconoce que el factor crítico para la entrega eficiente de siRNA depende de las propiedades de las partículas del fármaco ARNi en términos de tamaño, carga, forma, velocidad y densidad. Para la entrega eficiente de siRNA pulmonar, las partículas deben depositarse en el tracto respiratorio inferior. La deposición en la vía aérea se ve afectada por el tamaño de las partículas y la función pulmonar del paciente. Se encuentra que el tamaño de las partículas entre 1-5 μm es el más apropiado para la deposición en el tracto respiratorio inferior [23]. Además, la presencia de proteínas mucos y surfactantes, las acciones de aclaramiento mucociliar y la fagocitosis por Por lo tanto, los sistemas de parto generalmente requieren vectores de parto, y estos vectores necesitan ser diseñados con el fin de maximizar la deposición de siRNA en el área enferma del tracto respiratorio. Además, las barreras extracelulares al parto de siRNA también dependen de características fisiológicas del tracto respiratorio, que pueden cambiar con la enfermedad y características del paciente. En el estadio activo de la enfermedad pulmonar, las condiciones fisiológicas de las vías respiratorias podrían cambiar y tener un impacto significativo en la eficiencia del sistema de parto pulmonar. Durante la infección, inflamación y reacción alérgica, hay un aumento en la secreción de mucosidad junto con el aclaramiento mucociliar dañado [43]. Además, el asma y la EPOC son ambas condiciones inflamatorias crónicas del pulmón asociadas con "remodelación" estructural que no es apropiada para el mantenimiento de la función pulmonar normal [44]. Figura 2. Barreras extracelulares al parto de siRNA pulmonar. La característica anatómica del tracto respiratorio es su alto grado de ramificación. El moco alinea el epitelio respiratorio desde la cavidad nasal hasta los bronquios terminales. Las partículas depositadas en las células epiteliales ciliadas son rápidamente despejadas por las acciones de aclaramiento mucociliar. El muco y el aclaramiento mucociliar de las partículas atrapadas por mucosidad es un mecanismo de defensa pulmonar como barrera fisiológica. En las células alveolar, clara y alveolar tipo II se secretan en la superficie del epitelio alveolar, formando una capa delgada de surfactantes pulmonares. Los surfactantes actúan como barrera principal para el parto de siRNA porque reducen la eficiencia de la transfección. Además, los macrófagos ubicados en los alveolos absorbe Las partículas recogidas en los macrófagos se degradan posteriormente dentro de las células, los cuales presentan barreras importantes para el parto pulmonar dirigido; el segundo es el membrance de las células de las vías respiratorias y sus barreras intracelulares (Figura 3 ). Para el silenciamiento eficiente de los genes en los pulmones, los siRNAs deben ser entregados a su sitio de acción, ser estables, entrar en las células diana y estar presentes en el citoplasma a una concentración suficiente; una vez que los siRNAs alcanzan las células diana, deben ser transportados al citoplasma y llevados por Argonaute (Ago)2/complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que degrada los mRNAs y, posteriormente, suprime la expresión génica secuencia-específica; para que ocurra una endocitosis eficiente, las partículas deben tener un tamaño inferior a 150 nm. Las propiedades fisicoquímicas de los siRNA también juegan un papel significativo en el cruce de la membrana biológica. A pesar de su pequeño tamaño, la carga negativa y la degradabilidad química de las moléculas de siRNA les impiden cruzar fácilmente las membranas biológicas. Por lo tanto, los enfoques eficientes de siRNA necesitan superar esta limitación facilitando la captación celular. Una de las principales funciones de un vector de entrega es facilitar la captación celular de siRNA [46]. La complejación electrostática de moléculas de siRNA con lípidos y polímeros catiónicos ayuda a enmascarar su carga negativa neta. El complejo portador de siRNA con carga positiva interactúa con proteoglicanos aniónicos en la membrana celular, forma una vesícula endocítica, y entra en las células por endocitosis [47]. Después de la internalización celular, el complejo portador de siRNA en vesículas endocíticas es transportado a lo largo de microtúbulos a lisosomas que son colocalizados con el centro organizador de microtúbulos. Para evitar la degradación lisosómica, los siRNAs deben escapar del endosoma al citoplasma, donde pueden asociarse con la maquinaria ARNi. El escape endosomal es una barrera importante para la entrega eficiente de siRNA [48, 49]. El endosomal atrapamiento y la degradación lisosómica del siRNA y los portadores contribuyen a la baja eficiencia de transfección y es una dificultad importante para los vectores de entrega. Un agente de entrega ideal debe proteger los siRNAs de la degradación enzimática, facilitar la absorción celular, y promover la fuga endosomal dentro de las células con toxicidad insignificante. Se han reportado múltiples enfoques para la entrega de siRNAs, que van desde la administración directa relativamente simple de siRNAs con forma salina hasta enfoques de nanopartículas basadas en lípidos y polímeros y enfoques de conjugación y complejación de siRNAs [50]. La carga negativa y la degradabilidad química de los siRNAs bajo condiciones fisiológicamente relevantes hacen que su entrega sea un desafío importante. En consecuencia, la entrega de siRNAs generalmente requiere un vector o portadores para su transfección en las células diana. En general, se están evaluando vectores virales y no virales para la entrega de siRNAs a las células pulmonares. Algunos vectores virales, como retrovirus y adenovirus, han sido demostrados para mediar el silenciamiento genético en un modelo pulmonar in vitro [51] e inducir RNAi en una gama de tejidos animales [52]. Demostró que el siRNA mediado por lentivirus fue utilizado específicamente para derribar la expresión de la proteína nuclear 1 (NUPR1) in vivo, lo que resultó en un crecimiento tumoral inhibido [53]. Sin embargo, el parto basado en virus tiene varias desventajas. La respuesta inmune a los virus no sólo impide la entrega de genes sino que también tiene el potencial de causar complicaciones graves [54]. Casos recientes bien documentados, como la muerte de Jesse Gelsinger debido a complicaciones relacionadas con un vector de distribución adenoviral, destacan este problema [55]. Además, algunos vectores virales pueden insertar su genoma en posiciones aleatorias en el cromosoma huésped, lo que finalmente restringe la función génica [56].. Barreras intracelulares para la entrega de siRNA pulmonar. Las barreras a la internalización celular dependen de las propiedades superficiales del siRNA y los portadores (por ejemplo Después de que los siRNAs sean llevados exitosamente a las células diana por medio de endocitosis, las principales barreras para entregar siRNAs a su sitio de acción son la atrapación endosomal y la degradación lisosómica de siRNAs y portadores. Para dirigir el silenciamiento del gen diana, los siRNAs necesitan escapar del endosoma hacia el citoplasma, donde se asocian con el complejo silenciador inducido por Ago2/ARN (RISC) para dirigir la división de mRNAs con sitios de unión complementarios. Como alternativa a los vectores virales, los vectores no virales, incluyendo vectores basados en lípidos y polímeros, generalmente se han utilizado para la entrega de siRNAs a los pulmones debido a su toxicidad reducida [57]. Los vectores de entrega basados en lípidos se utilizan con éxito para producir siRNA in vitro e in vivo [58]. Los lípidos catiónicos están compuestos de cabeza cargada positivamente, un enlace e hidrofóbico. En general, los complejos basados en lípidos son fáciles de formular y se logra una buena eficacia de transfección debido a la interacción con la membrana celular cargada negativa. Muchos agentes de transfección de siRNA comerciales son sistemas de administración basados en lípidos, algunos de los cuales también se emplean para el parto pulmonar-DharmFECT [30], Oligofectamina [59], Lipofectamina [60] y TransIT-TKO [35]. Del mismo modo, los polímeros catiónicos también se han evaluado para la entrega de siRNA a las células pulmonares. Por otro lado, los vectores basados en lípidos también pueden inducir toxicidad y activación inespecífica de las respuestas inflamatorias de citocina e interferón [62, 63]. Aunque los vectores basados en polímero provocan una respuesta inmune relativamente menos fuerte que los vectores basados en lípidos, la administración efectiva de siRNA a un área local en enfermedades pulmonares requiere más atención al desarrollo de vectores de entrega no tóxicos. Un punto importante para la inhibición de la expresión génica mediada por siRNA es si los efectos observados son específicos y no debidos a efectos fuera de la meta y no están libres de respuestas potenciales de interferón [64, 65]. Curiosamente, algunos estudios han demostrado que fue posible administrar "siRNA desnuda" a ratones y regular un objetivo endógeno o exógeno sin inducir una respuesta de interferón [66]. Los siRNAs desnudos son degradados por las endonucleasas séricas y generalmente son eliminados por filtración glomerular, resultando en una corta semivida plasmática de < 10 min. Por lo tanto, algunos estudios de la entrega sistémica de siRNAs desnudos no han logrado reducir la regulación del gen objetivo [67, 68]. En contraste, también ha habido algunos éxitos en la entrega local de siRNAs desnudos a los pulmones [15, 16, 20, 31]. Algunos de ellos reportaron que el uso de vectores de distribución no mostró diferencia significativa en la eficiencia silenciadora de genes en comparación con la de los siRNAs desnudos [16, 35]. De hecho, en un ensayo clínico, se ha utilizado la entrega de siRNAs desnudos para el tratamiento de RSV [17, 38]. Esta evidencia exitosa puede ser debido a que los siRNAs desnudos para aplicaciones clínicas son altamente modificados químicamente para prevenir la degradación inducida por nucleasa y presumiblemente minimizar los efectos estimuladores inmunes. Aunque no está claro cómo los siRNAs desnudos cruzan la membrana celular, obtienen acceso al citoplasma y permanecen intactos para realizar su acción biológica, tanto los ensayos en animales como en humanos se han llevado a cabo exitosamente, mostrando la eficacia de los siRNAs desnudos (ALN-RSV01) que fueron administrados intranasalmente. Esta explicación no ha sido confirmada, pero el daño fisiológico de las células epiteliales respiratorias causadas por infección viral puede haber influido posiblemente en el misterio. El cambio activo en la membrana de células epiteliales de la vía aérea causada por enfermedad infecciosa podría afectar la internalización celular. Sin embargo, la ventaja de los siRNA desnudos sobre los vectores de parto en el tratamiento de enfermedades pulmonares es controvertida [69, 70]. Se requieren más investigaciones in vivo sobre los siRNA desnudos y los vectores no virales. La enfermedad pulmonar es una de las principales causas de muerte, y la disminución de la calidad de vida es responsable del sufrimiento de muchos pacientes. Varias enfermedades pulmonares hacen la vida extremadamente difícil para los pacientes, y los casos graves de estas enfermedades pulmonares pueden resultar en la muerte. Las altas tasas de muerte asociadas con el cáncer de pulmón se deben en parte al hecho de que es lamentablemente difícil de curar. Sobre todo, la EPOC es la cuarta causa de muerte en la mayoría de los países industrializados y se prevé que se convierta en tercera para 2020 [71]. Por lo tanto, se necesita una acción decisiva para frenar el aumento de la salud y la carga económica que esto representa. Las enfermedades pulmonares crónicas La aprobación de corticosteroides inhalados fue pionera en una nueva generación de terapia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, siendo la primera vez que se disponía de un producto antiinflamatorio para reducir la inflamación pulmonar característica en las vías respiratorias y la obstrucción asociada. Los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica. Sin embargo, se utilizan con limitaciones en la EPOC y asma de moderada a grave. Asimismo, el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares refractarias también depende de la terapia sistémica con corticosteroides. Muchos de estos pacientes también sufrieron diversos efectos secundarios del uso sistémico de corticosteroides, como aumento de peso e hiperglucemia no controlada. El tratamiento de la enfermedad pulmonar utilizando una orientación celular específica, así como técnicas RNAi, representan una estrategia novedosa y podrían proporcionar nuevas oportunidades en nanomedicina. Las aplicaciones pulmonares de siRNA in vivo son frecuentemente estudiadas y a menudo resultan en ensayos clínicos [57, 72]. Desde el descubrimiento de ARNi, el potencial terapéutico de los siRNAs ha sido rápidamente reconocido. En 2004, el primer ensayo clínico humano de terapia basada en ARNi se inició para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad con un siRNA dirigido al receptor de VEGF 1 entregado intravítreamente [73]. Se han realizado muchos estudios en los últimos años que involucran la entrega de siRNAs a los pulmones para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. La entrega a los pulmones será más importante para mover la tecnología de siRNAs a la clínica. Se están evaluando varias terapias basadas en siRNAs en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes condiciones, incluyendo enfermedades pulmonares como asma e infección por VSR. La Tabla 1 es un resumen de ensayos clínicos de terapias basadas en siRNAs [74]. El siRNA muestra potencial para el tratamiento de varias infecciones virales pulmonares, y se ha reportado que los tratamientos basados en el siRNA también pueden ser utilizados en el tratamiento de la gripe [13], el virus de la parainfluenza [35], el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) [14], y el VRS [35]. Sobre todo, el VRS es el objetivo terapéutico más prometedor de los siRNAs. El VRS es una causa común de infecciones respiratorias graves en lactantes y niños. También produce morbilidad y mortalidad significativas en poblaciones adultas inmunocomprometidas o ancianas [75]. No se dispone de una vacuna contra el VRS, y la única terapia antiviral aprobada para el VRS es indeseable para los pacientes pediátricos debido a su potencial teratogenicidad y eficacia limitada. El tratamiento basado en ARNi ha mostrado efectos prometedores en modelos murinos de infección por VRS [35]. El siRNA, ALN-RSV01, está dirigido contra el ARNm que codifica la proteína N del VRS que exhibe actividad anti-VRS específica in vitro e in vivo. Se entrega sin un vector de parto como aerosol nasal y se dirige al tracto respiratorio superior en lugar del área pulmonar inferior. ALN-RSV01 ha sido sometido a estudios completos de fase I intranasal e inhalación en adultos sanos y se ha encontrado que es generalmente bien tolerado [38]. Además, ALN-RSV01 ha sido evaluado en un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en pacientes trasplantados de pulmón con infección del tracto respiratorio RSV [76]. La administración de ALN-RSV01 a pacientes de trasplante de pulmón infectados por VRS fue segura y bien tolerada y asociada con una Basándose en estos resultados, se ha iniciado un ensayo multinacional más amplio, aleatorizado y doble ciego de fase IIb de ALN-RSV01 en pacientes con trasplante de pulmón para confirmar y extender estos hallazgos. El cáncer es un objetivo principal de la terapia basada en ARNi, ya que los oncogenes, los genes supresores de tumores mutados y varios otros genes que contribuyen a la progresión del tumor son objetivos potencialmente importantes para el silenciamiento de genes por ARNi. El cáncer de pulmón es uno de los tumores más frecuentes en todo el mundo con respecto a las tasas de incidencia y mortalidad. Los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican comúnmente en un estadio avanzado de la enfermedad y tienen opciones terapéuticas limitadas. La principal ventaja de la terapia ARNi en el cáncer podría ser la focalización simultánea de genes múltiples pertenecientes a diferentes vías celulares que participan en la progresión del tumor. La inhibición simultánea de varios genes también minimizaría el riesgo de resistencia a fármacos que normalmente se encuentran con terapias basadas en pequeñas moléculas, que involucran siRNAs y miRNAs. Ya ha habido mejoras significativas en los siRNAs para el tratamiento primario o metastásico del cáncer de pulmón al dirigirse a oncogenes como Akt1 [9], tumor de Wilms 1 (WT1) [12], genes sobreexpresados como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) [77], NUPR1 [53] y EZH2 [78]. Algunos de estos estudios han demostrado con éxito la eficacia de la terapia basada en ARNi mediante la administración intrapulmonar de siRNAs Aunque se deben diseñar estrategias para minimizar los efectos inmunoestimuladores fuera de objetivo y no específicos, estos datos sugieren que el silenciamiento del gen diana con siRNAs es una estrategia atractiva para la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón primario y metastásico. Actualmente hay algunos ensayos clínicos en curso que estiman la seguridad y eficacia de los fármacos basados en siRNAs para el tratamiento del cáncer. Atu027, un siRNA-lipoplex dirigido contra la proteína cinasa N3 (PKN3), previno la metástasis pulmonar en un ensayo de fase I de varios modelos de cáncer [79]. PKN3 es un efector aguas abajo de la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), que regula diversas respuestas celulares, incluyendo desarrollo, crecimiento y supervivencia [81]. Recientemente, PKN3 también ha sido considerado como una diana terapéutica adecuada para modular la angiogénesis tumoral debido a que la pérdida de análisis de función con Atu027 en células endoteliales primarias cultivadas mostró un papel esencial de PKN3 para la formación y migración de tubos endoteliales [79]. Atu027 puede ser considerado como un potencial siRNA para prevenir metástasis pulmonares y podría ser adecuado para prevenir metástasis hematógenas combinadas con terapia convencional del cáncer. La enfermedad pulmonar inflamatoria, también llamada EPOC, incluye una amplia gama de dolencias pulmonares. Estas enfermedades relacionadas incluyen asma, fibrosis pulmonar y bronquitis crónica. Están influenciadas por una combinación de componentes ambientales, genéticos y epigenéticos [82]. La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. La EPOC se asocia principalmente al tabaquismo, y estudios recientes que investigan la fisiopatología del enfisema han demostrado que el humo del cigarrillo puede causar que las células entren en la senescencia celular. Fumar puede causar senescencia a las células debido al daño del ADN a través del aumento del recambio celular, lo que a su vez conduce al acortamiento acelerado del telómero [84]. Últimamente, muchos estudios han investigado el papel de la senescencia celular en el desarrollo y la progresión de la EPOC [85]. Aunque varias clases de medicamentos, incluyendo corticosteroides inhalados, se utilizan para el tratamiento de la EPOC, ninguno de estos medicamentos ha demostrado mejorar significativamente la función pulmonar a largo plazo durante la progresión de la enfermedad. Muchas personas están desarrollando EPOC, y la causa de esta afección es complicada y no se comprende a fondo.Un factor clave es la susceptibilidad genética.Algunos estudios han mostrado una gran contribución genética a la variabilidad de la función pulmonar y EPOC [86, 87].Los polimorfismos en genes múltiples se han reportado asociados con EPOC [87], tales como factor de transcripción [por ejemplo factor nuclear-kappa B (NFoB)] [88], matriz extracelular (por ejemplo, matriz metaloproteinasa-12 (MMP-12)) [89, 90], citocinas [por ejemplo factor de necrosis tumoral (TNF)-α] [91], quimioquinas [por ejemplo. la interleucina (IL)-8, el receptor IL-8 y el receptor de quimiocina (CCR)1 [92, 93], y la apoptosis (por ejemplo, caspasa-3 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) [94, 95]. Muchos de ellos se han identificado como posibles blancos de la intervención terapéutica utilizando inhibidores de moléculas o antagonistas. Aunque varios tratamientos nuevos que se dirigen al proceso inflamatorio se encuentran ahora en desarrollo clínico, como inhibidores del TNF-α e inhibidores de la I-kappaB cinasa 2 (IKK2) [96, 97], los ensayos clínicos con siRNA nunca se han realizado en la EPOC. El retraso en el desarrollo de fármacos para la EPOC podría deberse a la aparición relativamente reciente de investigaciones que abordan la base molecular de la EPOC. Además, se necesitan más investigaciones para entender los mecanismos moleculares esenciales sobre la patogénesis de la EPOC y desarrollar técnicas de monitoreo para apoyar el desarrollo de terapias ARNi. Actualmente, no hay tratamientos disponibles que reduzcan la progresión de la EPOC o supriman la inflamación en las vías aéreas pequeñas y el parénquima pulmonar. El enfoque basado en los ARNi para las moléculas clave también tiene implicaciones potenciales para el tratamiento de la EPOC. El asma es también una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas caracterizada por síntomas variables y recurrentes y obstrucción reversible del flujo de aire. La Organización Mundial de la Salud estima que actualmente están afectadas 300 millones de personas y que, para el año 2025, otros 100 millones serán afectados por la enfermedad [98]. Los corticosteroides inhalados son muy eficaces en asma leve porque mejoran los síntomas y disminuyen las exacerbaciones. Aunque los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica para las enfermedades pulmonares inflamatorias, su uso no siempre es completamente efectivo y está asociado con efectos secundarios. Debido a estas limitaciones, está claro que hay una necesidad de nuevos tipos de medicamentos que pueden tratar y mejorar el pronóstico de asma moderada a grave. Se han identificado muchos genes diana que participan en la patogénesis del asma. Los objetivos más prometedores incluyen la codificación de genes para citoquinas (IL-4, IL5, IL-13), receptores de citoquinas y quimioquinas (IL-4 y CCR3), y tirosina quinasas [tirosina quinasa batida (Syk) y nuevas tirosina quinasa (Lyn) relacionadas con LCK/YES)], así como para factores de transcripción [transductores de señales y activadores de transcripción 1 (STAT1), STAT6, GATA3 y NF Actualmente, en un ensayo clínico para el asma, Excellair TM (ZaBeCor, Bala Cynwyd, PA, EE.UU.), se está utilizando un siRNA que se dirige a Syk. La cinasa está involucrada en la señalización de un receptor de células B y es un regulador clave de cascadas de señalización aguas abajo que en última instancia conducen a la activación de varios factores de transcripción proinflamatorios. Se ha reportado que los oligonucleótidos antisensibles administrados por aerosol fueron potentes para disminuir la expresión de Syk, liberación mediadora de macrófagos alveolares e inflamación pulmonar dependiente de Syk [102]. Además, se ha demostrado la inhibición de mediadores inflamatorios en un estudio utilizando siRNA dirigido a Syk en células epiteliales de vía aérea [103]. Algunos de los tratamientos actuales para el asma y otras condiciones inflamatorias, tales como inhibidores del TNF-α o inhibidores del leucotrieno, inhiben sólo uno de los mediadores de la inflamación. En contraste, el siRNA dirigido Syk busca inhibir un paso inicial de señalización de la inflamación y, por lo tanto, evitar la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. En general, el progreso reciente de los siRNAs a los pulmones también ha mejorado la viabilidad terapéutica de los ARNi para enfermedades pulmonares inflamatorias. El progreso rápido pondrá los tratamientos basados en el siRNA en una vía rápida a la clínica. MiRNAs son pequeños ARNs no codificantes endógenos que regulan la expresión génica reprimiendo la traducción o promoviendo la degradación de su mRNA objetivo. MiRNAs regulan la expresión génica mediante la unión a la 3′ región no traducida (UTR) de En el genoma humano, se estima que las transcripciones de aproximadamente el 60% de todos los ARNm están dirigidas por los miRNAs [104]. De acuerdo con su función, los miRNAs desempeñan un papel importante en los procesos celulares como desarrollo, proliferación y apoptosis de patologías pulmonares [105]. Se ha demostrado que un número creciente de miRNAs están involucrados en diferentes enfermedades pulmonares. Esta evidencia hace de los miRNAs una tecnología prometedora para el desarrollo terapéutico actual y futuro. Discutimos el papel de algunos miRNAs en diversas enfermedades pulmonares, así como el posible futuro de estos descubrimientos en aplicaciones clínicas.La Tabla 2 muestra el resumen de los miRNAs en el desarrollo terapéutico.En este punto, una terapia basada en miRNAs ya ha entrado en un ensayo clínico de fase II.Existe evidencia de que la regulación ascendente o descendente de los miRNAs es Muchos estudios se han centrado en el papel de los miRNAs en las enfermedades pulmonares inflamatorias, como la EPOC [116, 117], la fibrosis pulmonar [118] [118] [119] [129] y el asma [122] [123] [123] [125] [125] (Tabla 3). [130] [117, 129] La patogénesis de la EPOC se atribuye no sólo a la inflamación crónica en las vías respiratorias sino también a la inflamación sistémica [131]. El tabaquismo es el principal factor de riesgo para el desarrollo de la EPOC. Se ha demostrado que el tabaquismo causa cambios biológicos en la expresión génica de los pulmones [132], y hay algunos informes sobre los miRNAs relacionados con el tabaquismo [117, 129, 130]. Sin embargo, hay pocos informes que se centran en los miRNAs relacionados con la patogénesis de esta enfermedad con componentes inflamatorios sistémico El estudio reciente sobre fibroblastos pulmonares de pacientes con EPOC presenta menos expresión de miR-146a después de la estimulación con citocinas proinflamatorias en comparación con sujetos no EPOC con historias de tabaquismo similares [127]. La regulación descendente de miR-146a resultó en una vida media prolongada de ciclooxigenasa-2 del ARNm, aumentando así la prostaglandina E2 en fibroblastos de sujetos con EPOC. Además, Ezzie et al. investigaron la diferencia de perfiles de miRNA expresados en los pulmones de fumadores con y sin EPOC. Concluyeron que miR-223 y miR-1274a fueron los miRNA más afectados en sujetos con EPOC [126]. Sin embargo, la EPOC es un trastorno complejo, multicomponente y heterogéneo con una serie de diferentes procesos patológicos y subgrupos con sus propias características Se necesita una mejor comprensión de la complejidad de la enfermedad y de la potencial relevancia clínica de los miRNA identificados. La fibrosis pulmonar puede ser causada por una irritación identificable a los pulmones, pero en muchos casos se desconoce la causa, y las posibilidades terapéuticas son limitadas. El tabaquismo es uno de los factores de riesgo más reconocidos para el desarrollo de fibrosis pulmonar. Este trastorno se acompaña principalmente de una mayor expresión del mediador fibrótico clave que transforma el factor de crecimiento β (TGF-β) y otras citoquinas producidas en la lesión de fibrosis activa [128]. Recientemente, se informó que los miRNAs pueden desempeñar un papel regulador importante en el cambio fibromático pulmonar en los pulmones. La regulación descendente de let-7d en fibrosis pulmonar idiopática (IPF) resultó en un aumento de la deposición de colágeno y engrosamiento septal alveolar [119] En un modelo diferente de ratón asmático, se observó un aumento en la expresión de miR-21 en los pulmones [123]. Este informe podría contribuir a la comprensión del mecanismo inflamatorio en la vía aérea a través de la inhibición de IL-12, favoreciendo la respuesta de linfocitos Th2. Un receptor 4 (TLR4) inducido por Th2 induce una alta expresión de miR-126, y el bloqueo selectivo de miR-126 suprimió el fenotipo asmático [124]. Además, la remodelación de la vía aérea es una característica del asma y tiene importantes implicaciones funcionales. Rodríguez et al. han demostrado que miR-155 está relacionada con el desarrollo de infiltración inflamatoria en el pulmón y la remodelación de la vía aérea [122]. Así, algunos estudios presentan una conexión funcional entre la expresión de miRNA y la patogénesis del asma y sugieren que dirigir miRNA en las vías respiratorias puede conducir a tratamientos antiinflamatorios para el asma alérgica. A pesar de la evidencia de modelos experimentales, el perfil de expresión de miRNAs en biopsias de vías respiratorias de pacientes con asma leve antes y después del tratamiento con corticosteroides inhalados y en voluntarios sanos no reveló diferencias en la expresión de miRNAs [135]. Se requieren investigaciones adicionales sobre el papel de los miRNAs relacionados con la patogénesis del asma. Aunque la evidencia básica de la biología de miRNAs sigue proporcionando nuevas ideas, las aplicaciones de la terapia basada en miRNAs para enfermedades pulmonares inflamatorias son menos avanzadas que las del cáncer de pulmón [136]. Una razón de esto podría ser que la heterogeneidad de la enfermedad es causada por los efectos de muchos contaminantes ambientales del aire, incluyendo humo y compuestos orgánicos volátiles. La presencia de varios factores de riesgo complica la comprensión de la patogénesis de enfermedades pulmonares inflamatorias. La comprensión del papel que desempeñan los miRNAs en la modulación de la expresión génica, que conduce a sostener la patogénesis de las enfermedades pulmonares, es importante para el desarrollo de nuevas terapias que se centran en la prevención de la progresión de la enfermedad y el alivio de los síntomas. Dadas las importantes funciones que desempeñan los miRNAs en múltiples vías de carcinogénesis pulmonar, se están dedicando cada vez más esfuerzos a la investigación y desarrollo de terapias basadas en miRNAs, incluyendo la restauración de las funciones de miRNAs supresoras de tumores o la inhibición de miRNAs oncogénicos. El desarrollo de terapias basadas en miRNAs para el cáncer de pulmón está creciendo prósperamente con la ayuda de nuevas tecnologías ARNi. En comparación con las terapias basadas en siRNAs, que ya están en ensayos clínicos, los miRNAs son menos tóxicos y tienen el potencial de Los problemas críticos para el desarrollo de esta terapia son la entrega efectiva a los sitios de destino, la potencia de la terapia y la eliminación de los efectos fuera de la diana [137]. Hay dos estrategias como las aplicaciones terapéuticas de los miRNAs para el cáncer de pulmón [138]. Una estrategia es la terapia de reemplazo de miRNAs, que implica la reintroducción de un miRNA supresor tumoral imitado para restaurar una pérdida de la función. MiRNAs imitan a los duplex de ARN sintéticos diseñados para imitar las funciones endógenas de los miRNAs con modificaciones químicas para la estabilidad y la absorción celular. El concepto de terapia de reemplazo de miRNAs es más ejemplificado por el miRNAs let-7. let-7 es un miRNAs tumor-supresor en cáncer de pulmón no microcítico que se correlaciona inversamente con la expresión La administración intranasal de let-7 imitado en modelos de ratón de cáncer de pulmón redujo significativamente el crecimiento del tumor, lo que sugiere que la terapia de reemplazo de miRNA es realmente prometedora [106, 140, 141]. Otro miRNA que muestra el valor del reemplazo de miRNA es proporcionado por miR-34a [107, 142]. La administración local y/o sistémica de una miR-34a sintética imitada llevó a la acumulación de miR-34a en el tejido tumoral e inhibición del crecimiento del tumor pulmonar. Últimamente, Ling et al. también mostraron que el supresor miR-22 mostró actividad anti-cáncer pulmonar mediante la regulación post-transcripción de ErbB3 [143]. Así, las miRNA terapéuticas imitadas tienen un potencial poderoso atacando genes múltiples relevantes para varias enfermedades. Sin embargo, es necesario prestar atención a la toxicidad potencial en los tejidos normales en condiciones en las que la administración terapéutica de miRNA imita conducirá a una acumulación de miRNAs exógenos en células normales [138]. Aunque las suposiciones están bien fundadas, todavía hay evidencia insuficiente de toxicidad causada por miRNA imitaciones. De hecho, varios estudios in vivo fallaron en revelar efectos secundarios causados por los miRNA imitaciones y sugirió que la entrega de miRNA imitaciones a tejidos normales fue bien tolerada [107, 141]. Será importante investigar los efectos miRNAs imitados en células normales y evaluar cuidadosamente la toxicidad antes de utilizarlos en la práctica clínica. La segunda estrategia se dirige a una ganancia de función y tiene como objetivo inhibir oncomiRs mediante el uso de anti-miRNAs. Las modificaciones químicas, como el grupo 2'-O-metilo y el ácido nucleico bloqueado (LNA), aumentarían la estabilidad del oligo contra las nucleasas [144]. Los oligonucleótidos antisensibles contenidos en estas modificaciones se denominan antagomirs o "LNA-antimiRs" [144, 145]. Son oligonucleótidos con secuencias complementarias al miRNA endógeno e inhiben la función específica del miRNA. Se ha demostrado que un LNA-antimiR contra miR-122 silencia efectivamente miR-122 en primates no humanos [145], y los hallazgos apoyan el potencial de estos compuestos como una nueva clase terapéutica. Además, también se ha reportado que los anti-miR-150 suministrados en el tumor pulmonar xenoinjertos en ratones llevaron a un crecimiento tumoral inhibido En relación con estudios sobre miRNA imitados, estudios con oligonucleótidos antisensibles han mostrado evidencia efectiva con oligonucleótidos desnudos, lo que ilustra el potencial de modificaciones químicas de oligonucleótidos para mejorar su estabilidad, resistencia a la RNASa y propiedades farmacológicas, por lo que la inhibición de la función miRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificados se ha convertido en un enfoque importante y ampliamente utilizado. Datos recientes del primer estudio de fase II en pacientes con infección crónica por VHC tratados con el antimiR-122 modificado por LNA mostraron que este compuesto fue bien tolerado y proporcionó supresión viral continua. Un número creciente de estudios han examinado el potencial terapéutico de los miRNAs. Recientemente, ha surgido la evidencia de roles para miRNAs en la determinación de resistencia a fármacos [147]. En esta situación, la combinación de miRNA imita o antimiR con quimioterapia puede potenciar la eficacia del tratamiento del cáncer en el futuro. Además, los miRNA relacionados con las células madre cancerosas pueden ampliar significativamente el campo de la terapia basada en miRNA y sugerir que los miRNAs pueden ser herramientas potenciales para destruir las células cancerosas asociadas con la resistencia a la terapia, recurrencia y metástasis [108, 148]. Por lo tanto, el principal desafío es el suministro exitoso y las modificaciones químicas de los miRNAs terapéuticos al tejido objetivo sin dañar los tejidos normales. Los enfoques basados en ARNi proporcionan una modalidad terapéutica prometedora para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. Uno de los mayores desafíos en la terapia basada en ARNi sigue siendo el método de entrega de los siRNAs terapéuticos y miRNAs a las células objetivo. Las aplicaciones de parto pulmonar son muy atractivas, ya que tienden a ser no invasivas, son localmente restringidas y pueden ser administradas por el paciente. Una intervención terapéutica realista, como la aerosolización, puede mejorar la administración de fármacos en el lugar de acción y disminuir la exposición sistémica del paciente a la terapia, reduciendo así los efectos fuera de los objetivos. El avance de la entrega de siRNA pulmonar a la clínica ilustra que la terapia basada en ARNi ocupa un lugar central en el tratamiento futuro de las enfermedades pulmonares. Por otro lado, los miRNAs tienen la oportunidad de dirigir genes múltiples de una manera refinada, y la terapia basada en miRNA proporcionará un enfoque antitumoral y antiinflamatorio atractivo para diversas enfermedades pulmonares. En particular, la terapia antimiRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificado se ha convertido en una terapia potencial para las enfermedades pulmonares porque los oligonucleótidos El aumento de la evidencia ha indicado que los miRNA cumplen funciones causales en una variedad de enfermedades pulmonares y han impulsado investigaciones sobre su potencial como dianas terapéuticas. Para el desarrollo futuro se requieren una mayor comprensión de los mecanismos detallados de la terapia basada en ARNi y la investigación de métodos de parto más eficaces. Estos nuevos enfoques podrían abrir nuevas vías para diversas enfermedades pulmonares y mejorar el resultado clínico de los pacientes.
|
¿Qué tamaño de partícula ha demostrado ser más eficaz en la entrega a la vía aérea inferior?
| false
| 1,620
|
{
"text": [
"1-5 μm"
],
"answer_start": [
7557
]
}
|
1-5 μm
|
641
|
Las plataformas terapéuticas de RNAi para las enfermedades pulmonareshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816685/Fujita, Yu; Takeshita, Fumitaka; Kuwano, Kazuyoshi; Ochiya, Takahiro2013-02-06DOI:10.3390/ph6020223Licencia:cc-byAbstract: La interferencia del ARN (ARNi) se está convirtiendo rápidamente en un método importante para analizar las funciones genéticas en muchos eucariotas y promete el desarrollo de silenciamiento genético terapéutico. La inducción de RNAi se basa en los pequeños ARN silenciadores, que afectan a la degradación específica del ARN mensajero (ARNm). Los estudios de descubrimiento de fármacos y los tratamientos novedosos de los siRNAs están actualmente dirigidos a una amplia gama de enfermedades, incluyendo varias infecciones virales y cánceres. Las enfermedades pulmonares en general son blancos atractivos para las terapias de siRNAs debido a su letalidad y prevalencia. Además, el pulmón es accesible anatómicamente a los agentes terapéuticos a través de la vía intrapulmonar. Recientemente, la evidencia creciente indica que los miRNAs desempeñan un papel importante en las anomalías pulmonares, como la inflamación y la oncogénesis. Por lo tanto, los miRNAs están siendo dirigidos con fines terapéuticos. En esta revisión, presentamos estrategias para el parto de ARNi y discutimos el estado actual de la técnica RNAi basada en el arte para diversas enfermedades pulmonares. Texto: cirugía tradicional, Bivas-Benita et al. reportaron que no se produjo mortalidad como resultado del uso de Las aplicaciones endotraqueales están siendo utilizadas actualmente por muchos profesionales en el campo pulmonar [22, 34] ; esto es útil para estudiar la administración de fármacos pulmonares en ratones. Sin embargo, el enfoque es más complejo en humanos porque se utiliza una vía artificial para la entrega de medicamentos en los pulmones. Por lo tanto, el método se está utilizando en modelos animales para probar y evaluar su fiabilidad para posibles aplicaciones clínicas. Ruta intraqueal: bajo anestesia, la tráquea se expone quirúrgicamente, y se inserta un tubo o aguja a través de una incisión hecha entre los anillos traqueales. Complicaciones, tales como lesiones vasculares y fugas de aire, son posibles debido a la traqueotomía. b) Ruta endotraqueal: los siRNAs se rocian directamente desde la boca a los pulmones utilizando un aerolizador MicroSprayer ® (Penn-Century, Filadelfia, PA Es importante mantener una visión clara de la tráquea durante el procedimiento. El parto intranasal es otro método común de aplicación de fármacos pulmonares en estudios en animales. En muchos estudios, se ha demostrado éxito in vivo en la entrega de siRNAs a los pulmones intranasal [22, 35, 36 ]. Una configuración experimental de la entrega intranasal por pulverización o gotita es simple e indolora para el animal. Aunque el éxito en la entrega de siRNAs intranasal en roedores no puede ser completamente extrapolado al uso humano debido a las diferencias significativas en anatomía pulmonar [37], este enfoque tiene potencial para la aplicación clínica de siRNAs. Ensayos clínicos de fase II se han iniciado para el tratamiento de la infección por el virus sincitial respiratorio (RSV), haciendo uso de la aplicación intranasal de moléculas de siRNAs desnudas modificadas químicamente que se dirigen a los productos La entrada intranasal se ha utilizado durante mucho tiempo para administrar moléculas pequeñas, como proteínas, para el parto sistémico. Debido a que la mucosa nasal está altamente vascularizada, la entrega de un epitelio delgado de medicación a través de la superficie puede dar lugar a una rápida absorción del medicamento en la sangre. Por lo tanto, los siRNA administrados intranasalmente pueden depositarse en la nariz, y algunos de ellos pueden no poder llegar al tracto respiratorio inferior. De hecho, se ha informado que la aplicación intranasal de siRNAs no formulados dio lugar a una menor eficiencia de entrega y distribución pulmonar homogénea que la alcanzada con la aplicación intratraqueal [31]. El método intranasal es adecuado para algunas enfermedades pulmonares, como la infección respiratoria superior por VSR, y también tiene potencial para el parto sistémico en lugar de la entrega pulmonar de siRNAs. Por lo tanto, es importante considerar la vía de administración El uso de aerosoles para administrar medicamentos a los pulmones tiene un largo historial. La administración por inhalación es un método popular y no invasivo de administrar agentes a los pulmones. Hay varios dispositivos de inhalación disponibles para la entrega de medicamentos a los pulmones. Los inhaladores de dosis medidas (IDM) y los inhaladores de polvo seco (IDP) son los modos más comunes de administrar inhalación. Los inhaladores de dosis medidas son los inhaladores más utilizados para varias enfermedades pulmonares, como el asma, la bronquitis y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y un espaciador es un dispositivo externo que se une a una IDM para permitir una mejor administración de medicamentos mediante una mayor coordinación de la activación y la inhalación. Para la mayoría de los IDM, el propelente es uno o más gases llamados clorofluorocarbonos (CFC). Aunque los CFC en los medicamentos son seguros para que los pacientes inhalen, son perjudiciales para el medio ambiente. Por lo tanto, el desarrollo ulterior de los siRNA inhalables puede no ser la mejor manera de avanzar. Los DPI son dispositivos que entregan medicamentos a los pulmones en forma de polvo seco. El uso de los DPI ya ha demostrado ser prometedor para la entrega in vivo de macromoléculas terapéuticas como la insulina [39] y la heparina de bajo peso molecular [40] ; por lo tanto, podría ser un mejor dispositivo para la entrega de siRNAs a los pulmones. Las ventajas de los DPI son una mayor estabilidad y esterilidad de las biomoléculas sobre aerosoles líquidos y la formación libre de propelentes. Aunque los medicamentos se envían comúnmente a los pulmones por inhalación, la mayoría de los estudios in vivo que utilizan siRNAs se han basado en la entrega intratraqueal También se necesita un portador adecuado para proteger los ácidos nucleicos de la degradación debido a la fuerza de corte y al aumento de la temperatura durante el proceso de secado. Se ha demostrado el uso del secado por pulverización como técnica para la ingeniería de formulaciones en polvo seco de nanopartículas de siRNA, que podrían permitir la entrega local de siRNA biológicamente activo directamente al tejido pulmonar [24, 25]. En el futuro, la técnica es deseable para estimar el estudio in vivo sobre terapia de siRNA para inhalación. A largo plazo, anticipamos que habrá dispositivos más sofisticados para el uso clínico y que los que se están desarrollando serán más adecuados. Hay dos barreras principales para la entrega eficiente de siRNA pulmonar a las células del pulmón. La primera es la anatomía compleja y ramificada de los pulmones y barreras biomecánicas, como la capa de muco que cubre las células de las vías respiratorias [41, 42 La vía aérea consiste en bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y sacos alveolares. Todas estas estructuras contienen alvéolos, los diminutos sacos de aire en los que se produce el intercambio de gas. Generalmente se reconoce que el factor crítico para la entrega eficiente de siRNA depende de las propiedades de las partículas del fármaco ARNi en términos de tamaño, carga, forma, velocidad y densidad. Para la entrega eficiente de siRNA pulmonar, las partículas deben depositarse en el tracto respiratorio inferior. La deposición en la vía aérea se ve afectada por el tamaño de las partículas y la función pulmonar del paciente. Se encuentra que el tamaño de las partículas entre 1-5 μm es el más apropiado para la deposición en el tracto respiratorio inferior [23]. Además, la presencia de proteínas mucos y surfactantes, las acciones de aclaramiento mucociliar y la fagocitosis por Por lo tanto, los sistemas de parto generalmente requieren vectores de parto, y estos vectores necesitan ser diseñados con el fin de maximizar la deposición de siRNA en el área enferma del tracto respiratorio. Además, las barreras extracelulares al parto de siRNA también dependen de características fisiológicas del tracto respiratorio, que pueden cambiar con la enfermedad y características del paciente. En el estadio activo de la enfermedad pulmonar, las condiciones fisiológicas de las vías respiratorias podrían cambiar y tener un impacto significativo en la eficiencia del sistema de parto pulmonar. Durante la infección, inflamación y reacción alérgica, hay un aumento en la secreción de mucosidad junto con el aclaramiento mucociliar dañado [43]. Además, el asma y la EPOC son ambas condiciones inflamatorias crónicas del pulmón asociadas con "remodelación" estructural que no es apropiada para el mantenimiento de la función pulmonar normal [44]. Figura 2. Barreras extracelulares al parto de siRNA pulmonar. La característica anatómica del tracto respiratorio es su alto grado de ramificación. El moco alinea el epitelio respiratorio desde la cavidad nasal hasta los bronquios terminales. Las partículas depositadas en las células epiteliales ciliadas son rápidamente despejadas por las acciones de aclaramiento mucociliar. El muco y el aclaramiento mucociliar de las partículas atrapadas por mucosidad es un mecanismo de defensa pulmonar como barrera fisiológica. En las células alveolar, clara y alveolar tipo II se secretan en la superficie del epitelio alveolar, formando una capa delgada de surfactantes pulmonares. Los surfactantes actúan como barrera principal para el parto de siRNA porque reducen la eficiencia de la transfección. Además, los macrófagos ubicados en los alveolos absorbe Las partículas recogidas en los macrófagos se degradan posteriormente dentro de las células, los cuales presentan barreras importantes para el parto pulmonar dirigido; el segundo es el membrance de las células de las vías respiratorias y sus barreras intracelulares (Figura 3 ). Para el silenciamiento eficiente de los genes en los pulmones, los siRNAs deben ser entregados a su sitio de acción, ser estables, entrar en las células diana y estar presentes en el citoplasma a una concentración suficiente; una vez que los siRNAs alcanzan las células diana, deben ser transportados al citoplasma y llevados por Argonaute (Ago)2/complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que degrada los mRNAs y, posteriormente, suprime la expresión génica secuencia-específica; para que ocurra una endocitosis eficiente, las partículas deben tener un tamaño inferior a 150 nm. Las propiedades fisicoquímicas de los siRNA también juegan un papel significativo en el cruce de la membrana biológica. A pesar de su pequeño tamaño, la carga negativa y la degradabilidad química de las moléculas de siRNA les impiden cruzar fácilmente las membranas biológicas. Por lo tanto, los enfoques eficientes de siRNA necesitan superar esta limitación facilitando la captación celular. Una de las principales funciones de un vector de entrega es facilitar la captación celular de siRNA [46]. La complejación electrostática de moléculas de siRNA con lípidos y polímeros catiónicos ayuda a enmascarar su carga negativa neta. El complejo portador de siRNA con carga positiva interactúa con proteoglicanos aniónicos en la membrana celular, forma una vesícula endocítica, y entra en las células por endocitosis [47]. Después de la internalización celular, el complejo portador de siRNA en vesículas endocíticas es transportado a lo largo de microtúbulos a lisosomas que son colocalizados con el centro organizador de microtúbulos. Para evitar la degradación lisosómica, los siRNAs deben escapar del endosoma al citoplasma, donde pueden asociarse con la maquinaria ARNi. El escape endosomal es una barrera importante para la entrega eficiente de siRNA [48, 49]. El endosomal atrapamiento y la degradación lisosómica del siRNA y los portadores contribuyen a la baja eficiencia de transfección y es una dificultad importante para los vectores de entrega. Un agente de entrega ideal debe proteger los siRNAs de la degradación enzimática, facilitar la absorción celular, y promover la fuga endosomal dentro de las células con toxicidad insignificante. Se han reportado múltiples enfoques para la entrega de siRNAs, que van desde la administración directa relativamente simple de siRNAs con forma salina hasta enfoques de nanopartículas basadas en lípidos y polímeros y enfoques de conjugación y complejación de siRNAs [50]. La carga negativa y la degradabilidad química de los siRNAs bajo condiciones fisiológicamente relevantes hacen que su entrega sea un desafío importante. En consecuencia, la entrega de siRNAs generalmente requiere un vector o portadores para su transfección en las células diana. En general, se están evaluando vectores virales y no virales para la entrega de siRNAs a las células pulmonares. Algunos vectores virales, como retrovirus y adenovirus, han sido demostrados para mediar el silenciamiento genético en un modelo pulmonar in vitro [51] e inducir RNAi en una gama de tejidos animales [52]. Demostró que el siRNA mediado por lentivirus fue utilizado específicamente para derribar la expresión de la proteína nuclear 1 (NUPR1) in vivo, lo que resultó en un crecimiento tumoral inhibido [53]. Sin embargo, el parto basado en virus tiene varias desventajas. La respuesta inmune a los virus no sólo impide la entrega de genes sino que también tiene el potencial de causar complicaciones graves [54]. Casos recientes bien documentados, como la muerte de Jesse Gelsinger debido a complicaciones relacionadas con un vector de distribución adenoviral, destacan este problema [55]. Además, algunos vectores virales pueden insertar su genoma en posiciones aleatorias en el cromosoma huésped, lo que finalmente restringe la función génica [56].. Barreras intracelulares para la entrega de siRNA pulmonar. Las barreras a la internalización celular dependen de las propiedades superficiales del siRNA y los portadores (por ejemplo Después de que los siRNAs sean llevados exitosamente a las células diana por medio de endocitosis, las principales barreras para entregar siRNAs a su sitio de acción son la atrapación endosomal y la degradación lisosómica de siRNAs y portadores. Para dirigir el silenciamiento del gen diana, los siRNAs necesitan escapar del endosoma hacia el citoplasma, donde se asocian con el complejo silenciador inducido por Ago2/ARN (RISC) para dirigir la división de mRNAs con sitios de unión complementarios. Como alternativa a los vectores virales, los vectores no virales, incluyendo vectores basados en lípidos y polímeros, generalmente se han utilizado para la entrega de siRNAs a los pulmones debido a su toxicidad reducida [57]. Los vectores de entrega basados en lípidos se utilizan con éxito para producir siRNA in vitro e in vivo [58]. Los lípidos catiónicos están compuestos de cabeza cargada positivamente, un enlace e hidrofóbico. En general, los complejos basados en lípidos son fáciles de formular y se logra una buena eficacia de transfección debido a la interacción con la membrana celular cargada negativa. Muchos agentes de transfección de siRNA comerciales son sistemas de administración basados en lípidos, algunos de los cuales también se emplean para el parto pulmonar-DharmFECT [30], Oligofectamina [59], Lipofectamina [60] y TransIT-TKO [35]. Del mismo modo, los polímeros catiónicos también se han evaluado para la entrega de siRNA a las células pulmonares. Por otro lado, los vectores basados en lípidos también pueden inducir toxicidad y activación inespecífica de las respuestas inflamatorias de citocina e interferón [62, 63]. Aunque los vectores basados en polímero provocan una respuesta inmune relativamente menos fuerte que los vectores basados en lípidos, la administración efectiva de siRNA a un área local en enfermedades pulmonares requiere más atención al desarrollo de vectores de entrega no tóxicos. Un punto importante para la inhibición de la expresión génica mediada por siRNA es si los efectos observados son específicos y no debidos a efectos fuera de la meta y no están libres de respuestas potenciales de interferón [64, 65]. Curiosamente, algunos estudios han demostrado que fue posible administrar "siRNA desnuda" a ratones y regular un objetivo endógeno o exógeno sin inducir una respuesta de interferón [66]. Los siRNAs desnudos son degradados por las endonucleasas séricas y generalmente son eliminados por filtración glomerular, resultando en una corta semivida plasmática de < 10 min. Por lo tanto, algunos estudios de la entrega sistémica de siRNAs desnudos no han logrado reducir la regulación del gen objetivo [67, 68]. En contraste, también ha habido algunos éxitos en la entrega local de siRNAs desnudos a los pulmones [15, 16, 20, 31]. Algunos de ellos reportaron que el uso de vectores de distribución no mostró diferencia significativa en la eficiencia silenciadora de genes en comparación con la de los siRNAs desnudos [16, 35]. De hecho, en un ensayo clínico, se ha utilizado la entrega de siRNAs desnudos para el tratamiento de RSV [17, 38]. Esta evidencia exitosa puede ser debido a que los siRNAs desnudos para aplicaciones clínicas son altamente modificados químicamente para prevenir la degradación inducida por nucleasa y presumiblemente minimizar los efectos estimuladores inmunes. Aunque no está claro cómo los siRNAs desnudos cruzan la membrana celular, obtienen acceso al citoplasma y permanecen intactos para realizar su acción biológica, tanto los ensayos en animales como en humanos se han llevado a cabo exitosamente, mostrando la eficacia de los siRNAs desnudos (ALN-RSV01) que fueron administrados intranasalmente. Esta explicación no ha sido confirmada, pero el daño fisiológico de las células epiteliales respiratorias causadas por infección viral puede haber influido posiblemente en el misterio. El cambio activo en la membrana de células epiteliales de la vía aérea causada por enfermedad infecciosa podría afectar la internalización celular. Sin embargo, la ventaja de los siRNA desnudos sobre los vectores de parto en el tratamiento de enfermedades pulmonares es controvertida [69, 70]. Se requieren más investigaciones in vivo sobre los siRNA desnudos y los vectores no virales. La enfermedad pulmonar es una de las principales causas de muerte, y la disminución de la calidad de vida es responsable del sufrimiento de muchos pacientes. Varias enfermedades pulmonares hacen la vida extremadamente difícil para los pacientes, y los casos graves de estas enfermedades pulmonares pueden resultar en la muerte. Las altas tasas de muerte asociadas con el cáncer de pulmón se deben en parte al hecho de que es lamentablemente difícil de curar. Sobre todo, la EPOC es la cuarta causa de muerte en la mayoría de los países industrializados y se prevé que se convierta en tercera para 2020 [71]. Por lo tanto, se necesita una acción decisiva para frenar el aumento de la salud y la carga económica que esto representa. Las enfermedades pulmonares crónicas La aprobación de corticosteroides inhalados fue pionera en una nueva generación de terapia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, siendo la primera vez que se disponía de un producto antiinflamatorio para reducir la inflamación pulmonar característica en las vías respiratorias y la obstrucción asociada. Los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica. Sin embargo, se utilizan con limitaciones en la EPOC y asma de moderada a grave. Asimismo, el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares refractarias también depende de la terapia sistémica con corticosteroides. Muchos de estos pacientes también sufrieron diversos efectos secundarios del uso sistémico de corticosteroides, como aumento de peso e hiperglucemia no controlada. El tratamiento de la enfermedad pulmonar utilizando una orientación celular específica, así como técnicas RNAi, representan una estrategia novedosa y podrían proporcionar nuevas oportunidades en nanomedicina. Las aplicaciones pulmonares de siRNA in vivo son frecuentemente estudiadas y a menudo resultan en ensayos clínicos [57, 72]. Desde el descubrimiento de ARNi, el potencial terapéutico de los siRNAs ha sido rápidamente reconocido. En 2004, el primer ensayo clínico humano de terapia basada en ARNi se inició para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad con un siRNA dirigido al receptor de VEGF 1 entregado intravítreamente [73]. Se han realizado muchos estudios en los últimos años que involucran la entrega de siRNAs a los pulmones para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. La entrega a los pulmones será más importante para mover la tecnología de siRNAs a la clínica. Se están evaluando varias terapias basadas en siRNAs en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes condiciones, incluyendo enfermedades pulmonares como asma e infección por VSR. La Tabla 1 es un resumen de ensayos clínicos de terapias basadas en siRNAs [74]. El siRNA muestra potencial para el tratamiento de varias infecciones virales pulmonares, y se ha reportado que los tratamientos basados en el siRNA también pueden ser utilizados en el tratamiento de la gripe [13], el virus de la parainfluenza [35], el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) [14], y el VRS [35]. Sobre todo, el VRS es el objetivo terapéutico más prometedor de los siRNAs. El VRS es una causa común de infecciones respiratorias graves en lactantes y niños. También produce morbilidad y mortalidad significativas en poblaciones adultas inmunocomprometidas o ancianas [75]. No se dispone de una vacuna contra el VRS, y la única terapia antiviral aprobada para el VRS es indeseable para los pacientes pediátricos debido a su potencial teratogenicidad y eficacia limitada. El tratamiento basado en ARNi ha mostrado efectos prometedores en modelos murinos de infección por VRS [35]. El siRNA, ALN-RSV01, está dirigido contra el ARNm que codifica la proteína N del VRS que exhibe actividad anti-VRS específica in vitro e in vivo. Se entrega sin un vector de parto como aerosol nasal y se dirige al tracto respiratorio superior en lugar del área pulmonar inferior. ALN-RSV01 ha sido sometido a estudios completos de fase I intranasal e inhalación en adultos sanos y se ha encontrado que es generalmente bien tolerado [38]. Además, ALN-RSV01 ha sido evaluado en un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en pacientes trasplantados de pulmón con infección del tracto respiratorio RSV [76]. La administración de ALN-RSV01 a pacientes de trasplante de pulmón infectados por VRS fue segura y bien tolerada y asociada con una Basándose en estos resultados, se ha iniciado un ensayo multinacional más amplio, aleatorizado y doble ciego de fase IIb de ALN-RSV01 en pacientes con trasplante de pulmón para confirmar y extender estos hallazgos. El cáncer es un objetivo principal de la terapia basada en ARNi, ya que los oncogenes, los genes supresores de tumores mutados y varios otros genes que contribuyen a la progresión del tumor son objetivos potencialmente importantes para el silenciamiento de genes por ARNi. El cáncer de pulmón es uno de los tumores más frecuentes en todo el mundo con respecto a las tasas de incidencia y mortalidad. Los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican comúnmente en un estadio avanzado de la enfermedad y tienen opciones terapéuticas limitadas. La principal ventaja de la terapia ARNi en el cáncer podría ser la focalización simultánea de genes múltiples pertenecientes a diferentes vías celulares que participan en la progresión del tumor. La inhibición simultánea de varios genes también minimizaría el riesgo de resistencia a fármacos que normalmente se encuentran con terapias basadas en pequeñas moléculas, que involucran siRNAs y miRNAs. Ya ha habido mejoras significativas en los siRNAs para el tratamiento primario o metastásico del cáncer de pulmón al dirigirse a oncogenes como Akt1 [9], tumor de Wilms 1 (WT1) [12], genes sobreexpresados como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1R) [77], NUPR1 [53] y EZH2 [78]. Algunos de estos estudios han demostrado con éxito la eficacia de la terapia basada en ARNi mediante la administración intrapulmonar de siRNAs Aunque se deben diseñar estrategias para minimizar los efectos inmunoestimuladores fuera de objetivo y no específicos, estos datos sugieren que el silenciamiento del gen diana con siRNAs es una estrategia atractiva para la prevención y el tratamiento del cáncer de pulmón primario y metastásico. Actualmente hay algunos ensayos clínicos en curso que estiman la seguridad y eficacia de los fármacos basados en siRNAs para el tratamiento del cáncer. Atu027, un siRNA-lipoplex dirigido contra la proteína cinasa N3 (PKN3), previno la metástasis pulmonar en un ensayo de fase I de varios modelos de cáncer [79]. PKN3 es un efector aguas abajo de la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), que regula diversas respuestas celulares, incluyendo desarrollo, crecimiento y supervivencia [81]. Recientemente, PKN3 también ha sido considerado como una diana terapéutica adecuada para modular la angiogénesis tumoral debido a que la pérdida de análisis de función con Atu027 en células endoteliales primarias cultivadas mostró un papel esencial de PKN3 para la formación y migración de tubos endoteliales [79]. Atu027 puede ser considerado como un potencial siRNA para prevenir metástasis pulmonares y podría ser adecuado para prevenir metástasis hematógenas combinadas con terapia convencional del cáncer. La enfermedad pulmonar inflamatoria, también llamada EPOC, incluye una amplia gama de dolencias pulmonares. Estas enfermedades relacionadas incluyen asma, fibrosis pulmonar y bronquitis crónica. Están influenciadas por una combinación de componentes ambientales, genéticos y epigenéticos [82]. La EPOC es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. La EPOC se asocia principalmente al tabaquismo, y estudios recientes que investigan la fisiopatología del enfisema han demostrado que el humo del cigarrillo puede causar que las células entren en la senescencia celular. Fumar puede causar senescencia a las células debido al daño del ADN a través del aumento del recambio celular, lo que a su vez conduce al acortamiento acelerado del telómero [84]. Últimamente, muchos estudios han investigado el papel de la senescencia celular en el desarrollo y la progresión de la EPOC [85]. Aunque varias clases de medicamentos, incluyendo corticosteroides inhalados, se utilizan para el tratamiento de la EPOC, ninguno de estos medicamentos ha demostrado mejorar significativamente la función pulmonar a largo plazo durante la progresión de la enfermedad. Muchas personas están desarrollando EPOC, y la causa de esta afección es complicada y no se comprende a fondo.Un factor clave es la susceptibilidad genética.Algunos estudios han mostrado una gran contribución genética a la variabilidad de la función pulmonar y EPOC [86, 87].Los polimorfismos en genes múltiples se han reportado asociados con EPOC [87], tales como factor de transcripción [por ejemplo factor nuclear-kappa B (NFoB)] [88], matriz extracelular (por ejemplo, matriz metaloproteinasa-12 (MMP-12)) [89, 90], citocinas [por ejemplo factor de necrosis tumoral (TNF)-α] [91], quimioquinas [por ejemplo. la interleucina (IL)-8, el receptor IL-8 y el receptor de quimiocina (CCR)1 [92, 93], y la apoptosis (por ejemplo, caspasa-3 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) [94, 95]. Muchos de ellos se han identificado como posibles blancos de la intervención terapéutica utilizando inhibidores de moléculas o antagonistas. Aunque varios tratamientos nuevos que se dirigen al proceso inflamatorio se encuentran ahora en desarrollo clínico, como inhibidores del TNF-α e inhibidores del complejo I-kappaB cinasa 2 (IKK2) [96, 97], los ensayos clínicos con siRNA nunca se han realizado en la EPOC. El retraso en el desarrollo de fármacos para la EPOC podría deberse a la aparición relativamente reciente de investigaciones que abordan la base molecular de la EPOC. Además, se necesitan más investigaciones para entender los mecanismos moleculares esenciales sobre la patogénesis de la EPOC y desarrollar técnicas de monitoreo para apoyar el desarrollo de terapias ARNi. Actualmente, no hay tratamientos disponibles que reduzcan la progresión de la EPOC o supriman la inflamación en las vías aéreas pequeñas y el parénquima pulmonar. El enfoque basado en los ARNi para las moléculas clave también tiene implicaciones potenciales para el tratamiento de la EPOC. El asma es también una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas caracterizada por síntomas variables y recurrentes y obstrucción reversible del flujo de aire. La Organización Mundial de la Salud estima que actualmente están afectadas 300 millones de personas y que, para el año 2025, otros 100 millones serán afectados por la enfermedad [98]. Los corticosteroides inhalados son muy eficaces en asma leve porque mejoran los síntomas y disminuyen las exacerbaciones. Aunque los corticosteroides siguen siendo una importante intervención terapéutica para las enfermedades pulmonares inflamatorias, su uso no siempre es completamente efectivo y está asociado con efectos secundarios. Debido a estas limitaciones, está claro que hay una necesidad de nuevos tipos de medicamentos que pueden tratar y mejorar el pronóstico de asma moderada a grave. Se han identificado muchos genes diana que participan en la patogénesis del asma. Los objetivos más prometedores incluyen la codificación de genes para citoquinas (IL-4, IL5, IL-13), receptores de citoquinas y quimioquinas (IL-4 y CCR3), y tirosina quinasas [tirosina quinasa batida (Syk) y nuevas tirosina quinasa (Lyn) relacionadas con LCK/YES)], así como para factores de transcripción [transductores de señales y activadores de transcripción 1 (STAT1), STAT6, GATA3 y NF Actualmente, en un ensayo clínico para el asma, Excellair TM (ZaBeCor, Bala Cynwyd, PA, EE.UU.), se está utilizando un siRNA que se dirige a Syk. La cinasa está involucrada en la señalización de un receptor de células B y es un regulador clave de cascadas de señalización aguas abajo que en última instancia conducen a la activación de varios factores de transcripción proinflamatorios. Se ha reportado que los oligonucleótidos antisensibles administrados por aerosol fueron potentes para disminuir la expresión de Syk, liberación mediadora de macrófagos alveolares e inflamación pulmonar dependiente de Syk [102]. Además, se ha demostrado la inhibición de mediadores inflamatorios en un estudio utilizando siRNA dirigido a Syk en células epiteliales de vía aérea [103]. Algunos de los tratamientos actuales para el asma y otras condiciones inflamatorias, tales como inhibidores del TNF-α o inhibidores del leucotrieno, inhiben sólo uno de los mediadores de la inflamación. En contraste, el siRNA dirigido Syk busca inhibir un paso inicial de señalización de la inflamación y, por lo tanto, evitar la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. En general, el progreso reciente de los siRNAs a los pulmones también ha mejorado la viabilidad terapéutica de los ARNi para enfermedades pulmonares inflamatorias. El progreso rápido pondrá los tratamientos basados en el siRNA en una vía rápida a la clínica. MiRNAs son pequeños ARNs no codificantes endógenos que regulan la expresión génica reprimiendo la traducción o promoviendo la degradación de su mRNA objetivo. MiRNAs regulan la expresión génica mediante la unión a la 3′ región no traducida (UTR) de En el genoma humano, se estima que las transcripciones de aproximadamente el 60% de todos los ARNm están dirigidas por los miRNAs [104]. De acuerdo con su función, los miRNAs desempeñan un papel importante en los procesos celulares como desarrollo, proliferación y apoptosis de patologías pulmonares [105]. Se ha demostrado que un número creciente de miRNAs están involucrados en diferentes enfermedades pulmonares. Esta evidencia hace de los miRNAs una tecnología prometedora para el desarrollo terapéutico actual y futuro. Discutimos el papel de algunos miRNAs en diversas enfermedades pulmonares, así como el posible futuro de estos descubrimientos en aplicaciones clínicas.La Tabla 2 muestra el resumen de los miRNAs en el desarrollo terapéutico.En este punto, una terapia basada en miRNAs ya ha entrado en un ensayo clínico de fase II.Existe evidencia de que la regulación ascendente o descendente de los miRNAs es Muchos estudios se han centrado en el papel de los miRNAs en las enfermedades pulmonares inflamatorias, como la EPOC [116, 117], la fibrosis pulmonar [118] [118] [119] [129] y el asma [122] [123] [123] [125] [125] (Tabla 3). [130] [117, 129] La patogénesis de la EPOC se atribuye no sólo a la inflamación crónica en las vías respiratorias sino también a la inflamación sistémica [131]. El tabaquismo es el principal factor de riesgo para el desarrollo de la EPOC. Se ha demostrado que el tabaquismo causa cambios biológicos en la expresión génica de los pulmones [132], y hay algunos informes sobre los miRNAs relacionados con el tabaquismo [117, 129, 130]. Sin embargo, hay pocos informes que se centran en los miRNAs relacionados con la patogénesis de esta enfermedad con componentes inflamatorios sistémico El estudio reciente sobre fibroblastos pulmonares de pacientes con EPOC presenta menos expresión de miR-146a después de la estimulación con citocinas proinflamatorias en comparación con sujetos no EPOC con historias de tabaquismo similares [127]. La regulación descendente de miR-146a resultó en una vida media prolongada de ciclooxigenasa-2 del ARNm, aumentando así la prostaglandina E2 en fibroblastos de sujetos con EPOC. Además, Ezzie et al. investigaron la diferencia de perfiles de miRNA expresados en los pulmones de fumadores con y sin EPOC. Concluyeron que miR-223 y miR-1274a fueron los miRNA más afectados en sujetos con EPOC [126]. Sin embargo, la EPOC es un trastorno complejo, multicomponente y heterogéneo con una serie de diferentes procesos patológicos y subgrupos con sus propias características Se necesita una mejor comprensión de la complejidad de la enfermedad y de la potencial relevancia clínica de los miRNA identificados. La fibrosis pulmonar puede ser causada por una irritación identificable a los pulmones, pero en muchos casos se desconoce la causa, y las posibilidades terapéuticas son limitadas. El tabaquismo es uno de los factores de riesgo más reconocidos para el desarrollo de fibrosis pulmonar. Este trastorno se acompaña principalmente de una mayor expresión del mediador fibrótico clave que transforma el factor de crecimiento β (TGF-β) y otras citoquinas producidas en la lesión de fibrosis activa [128]. Recientemente, se informó que los miRNAs pueden desempeñar un papel regulador importante en el cambio fibromático pulmonar en los pulmones. La regulación descendente de let-7d en fibrosis pulmonar idiopática (IPF) resultó en un aumento de la deposición de colágeno y engrosamiento septal alveolar [119] En un modelo diferente de ratón asmático, se observó un aumento en la expresión de miR-21 en los pulmones [123]. Este informe podría contribuir a la comprensión del mecanismo inflamatorio en la vía aérea a través de la inhibición de IL-12, favoreciendo la respuesta de linfocitos Th2. Un receptor 4 (TLR4) inducido por Th2 induce una alta expresión de miR-126, y el bloqueo selectivo de miR-126 suprimió el fenotipo asmático [124]. Además, la remodelación de la vía aérea es una característica del asma y tiene importantes implicaciones funcionales. Rodríguez et al. han demostrado que miR-155 está relacionada con el desarrollo de infiltración inflamatoria en el pulmón y la remodelación de la vía aérea [122]. Así, algunos estudios presentan una conexión funcional entre la expresión de miRNA y la patogénesis del asma y sugieren que dirigir miRNA en las vías respiratorias puede conducir a tratamientos antiinflamatorios para el asma alérgica. A pesar de la evidencia de modelos experimentales, el perfil de expresión de miRNAs en biopsias de vías respiratorias de pacientes con asma leve antes y después del tratamiento con corticosteroides inhalados y en voluntarios sanos no reveló diferencias en la expresión de miRNAs [135]. Se requieren investigaciones adicionales sobre el papel de los miRNAs relacionados con la patogénesis del asma. Aunque la evidencia básica de la biología de miRNAs sigue proporcionando nuevas ideas, las aplicaciones de la terapia basada en miRNAs para enfermedades pulmonares inflamatorias son menos avanzadas que las del cáncer de pulmón [136]. Una razón de esto podría ser que la heterogeneidad de la enfermedad es causada por los efectos de muchos contaminantes ambientales del aire, incluyendo humo y compuestos orgánicos volátiles. La presencia de varios factores de riesgo complica la comprensión de la patogénesis de enfermedades pulmonares inflamatorias. La comprensión del papel que desempeñan los miRNAs en la modulación de la expresión génica, que conduce a sostener la patogénesis de las enfermedades pulmonares, es importante para el desarrollo de nuevas terapias que se centran en la prevención de la progresión de la enfermedad y el alivio de los síntomas. Dadas las importantes funciones que desempeñan los miRNAs en múltiples vías de carcinogénesis pulmonar, se están dedicando cada vez más esfuerzos a la investigación y desarrollo de terapias basadas en miRNAs, incluyendo la restauración de las funciones de miRNAs supresoras de tumores o la inhibición de miRNAs oncogénicos. El desarrollo de terapias basadas en miRNAs para el cáncer de pulmón está creciendo prósperamente con la ayuda de nuevas tecnologías ARNi. En comparación con las terapias basadas en siRNAs, que ya están en ensayos clínicos, los miRNAs son menos tóxicos y tienen el potencial de Los problemas críticos para el desarrollo de esta terapia son la entrega efectiva a los sitios de destino, la potencia de la terapia y la eliminación de los efectos fuera de la diana [137]. Hay dos estrategias como las aplicaciones terapéuticas de los miRNAs para el cáncer de pulmón [138]. Una estrategia es la terapia de reemplazo de miRNAs, que implica la reintroducción de un miRNA supresor tumoral imitado para restaurar una pérdida de la función. MiRNAs imitan a los duplex de ARN sintéticos diseñados para imitar las funciones endógenas de los miRNAs con modificaciones químicas para la estabilidad y la absorción celular. El concepto de terapia de reemplazo de miRNAs es más ejemplificado por el miRNAs let-7. let-7 es un miRNAs tumor-supresor en cáncer de pulmón no microcítico que se correlaciona inversamente con la expresión La administración intranasal de let-7 imitado en modelos de ratón de cáncer de pulmón redujo significativamente el crecimiento del tumor, lo que sugiere que la terapia de reemplazo de miRNA es realmente prometedora [106, 140, 141]. Otro miRNA que muestra el valor del reemplazo de miRNA es proporcionado por miR-34a [107, 142]. La administración local y/o sistémica de una miR-34a sintética imitada llevó a la acumulación de miR-34a en el tejido tumoral e inhibición del crecimiento del tumor pulmonar. Últimamente, Ling et al. también mostraron que el supresor miR-22 mostró actividad anti-cáncer pulmonar mediante la regulación post-transcripción de ErbB3 [143]. Así, las miRNA terapéuticas imitadas tienen un potencial poderoso atacando genes múltiples relevantes para varias enfermedades. Sin embargo, es necesario prestar atención a la toxicidad potencial en los tejidos normales en condiciones en las que la administración terapéutica de miRNA imita conducirá a una acumulación de miRNAs exógenos en células normales [138]. Aunque las suposiciones están bien fundadas, todavía hay evidencia insuficiente de toxicidad causada por miRNA imitaciones. De hecho, varios estudios in vivo fallaron en revelar efectos secundarios causados por los miRNA imitaciones y sugirió que la entrega de miRNA imitaciones a tejidos normales fue bien tolerada [107, 141]. Será importante investigar los efectos miRNAs imitados en células normales y evaluar cuidadosamente la toxicidad antes de utilizarlos en la práctica clínica. La segunda estrategia se dirige a una ganancia de función y tiene como objetivo inhibir oncomiRs mediante el uso de anti-miRNAs. Las modificaciones químicas, como el grupo 2'-O-metilo y el ácido nucleico bloqueado (LNA), aumentarían la estabilidad del oligo contra las nucleasas [144]. Los oligonucleótidos antisensibles contenidos en estas modificaciones se denominan antagomirs o "LNA-antimiRs" [144, 145]. Son oligonucleótidos con secuencias complementarias al miRNA endógeno e inhiben la función específica del miRNA. Se ha demostrado que un LNA-antimiR contra miR-122 silencia efectivamente miR-122 en primates no humanos [145], y los hallazgos apoyan el potencial de estos compuestos como una nueva clase terapéutica. Además, también se ha reportado que los anti-miR-150 suministrados en el tumor pulmonar xenoinjertos en ratones llevaron a un crecimiento tumoral inhibido En relación con estudios sobre miRNA imitados, estudios con oligonucleótidos antisensibles han mostrado evidencia efectiva con oligonucleótidos desnudos, lo que ilustra el potencial de modificaciones químicas de oligonucleótidos para mejorar su estabilidad, resistencia a la RNASa y propiedades farmacológicas, por lo que la inhibición de la función miRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificados se ha convertido en un enfoque importante y ampliamente utilizado. Datos recientes del primer estudio de fase II en pacientes con infección crónica por VHC tratados con el antimiR-122 modificado por LNA mostraron que este compuesto fue bien tolerado y proporcionó supresión viral continua. Un número creciente de estudios han examinado el potencial terapéutico de los miRNAs. Recientemente, ha surgido la evidencia de roles para miRNAs en la determinación de resistencia a fármacos [147]. En esta situación, la combinación de miRNA imita o antimiR con quimioterapia puede potenciar la eficacia del tratamiento del cáncer en el futuro. Además, los miRNA relacionados con las células madre cancerosas pueden ampliar significativamente el campo de la terapia basada en miRNA y sugerir que los miRNAs pueden ser herramientas potenciales para destruir las células cancerosas asociadas con la resistencia a la terapia, recurrencia y metástasis [108, 148]. Por lo tanto, el principal desafío es el suministro exitoso y las modificaciones químicas de los miRNAs terapéuticos al tejido objetivo sin dañar los tejidos normales. Los enfoques basados en ARNi proporcionan una modalidad terapéutica prometedora para el tratamiento de diversas enfermedades pulmonares. Uno de los mayores desafíos en la terapia basada en ARNi sigue siendo el método de entrega de los siRNAs terapéuticos y miRNAs a las células objetivo. Las aplicaciones de parto pulmonar son muy atractivas, ya que tienden a ser no invasivas, son localmente restringidas y pueden ser administradas por el paciente. Una intervención terapéutica realista, como la aerosolización, puede mejorar la administración de fármacos en el lugar de acción y disminuir la exposición sistémica del paciente a la terapia, reduciendo así los efectos fuera de los objetivos. El avance de la entrega de siRNA pulmonar a la clínica ilustra que la terapia basada en ARNi ocupa un lugar central en el tratamiento futuro de las enfermedades pulmonares. Por otro lado, los miRNAs tienen la oportunidad de dirigir genes múltiples de una manera refinada, y la terapia basada en miRNA proporcionará un enfoque antitumoral y antiinflamatorio atractivo para diversas enfermedades pulmonares. En particular, la terapia antimiRNA por antimiR oligonucleótidos químicamente modificado se ha convertido en una terapia potencial para las enfermedades pulmonares porque los oligonucleótidos El aumento de la evidencia ha indicado que los miRNA cumplen funciones causales en una variedad de enfermedades pulmonares y han impulsado investigaciones sobre su potencial como dianas terapéuticas. Para el desarrollo futuro se requieren una mayor comprensión de los mecanismos detallados de la terapia basada en ARNi y la investigación de métodos de parto más eficaces. Estos nuevos enfoques podrían abrir nuevas vías para diversas enfermedades pulmonares y mejorar el resultado clínico de los pacientes.
|
¿Cuáles son las condiciones esenciales en el suministro de siRNA para producir efectivamente silenciamiento genético en los pulmones?
| false
| 1,621
|
{
"text": [
"delivered to their site of action, be stable, enter the target cells, and be present in the cytoplasm at sufficient concentration"
],
"answer_start": [
10025
]
}
|
entregados a su lugar de acción, ser estables, entrar en las células diana, y estar presentes en el citoplasma a una concentración suficiente
|
1,547
|
Secuencia completa del genoma de una cepa del virus de la bronquitis infecciosa nefropatía aislada en Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3795213/SHA: f2df4fc3c60338755fd23da3d7e01c0455e20745Autores: Yang, Jing-tian; Ma, Bing-cunFecha: 2013-10DOI: 10.1128/genomea.0081-13Licencia: cc-byAbstract: El virus de la bronquitis infecciosa (IBV) causa enormes pérdidas económicas a la industria avícola. Texto: enfermedad tagiosa y aguda en pollos domésticos, pertenece al grupo III del género Coronavirus en la familia Coronaviridae (1). Es un virus de ARN (ssRNA) envuelto, no segmentado, de sentido positivo y de una sola cadena y tiene un genoma de aproximadamente 27,6 kb (2). Recientemente, muchos informes de análisis epidemiológicos han sugerido que las IBV nefropatógenas se han vuelto cada vez más frecuentes (3) (4) (5) (6) en China. En este trabajo, se analizó la secuencia completa del genoma de un aislado llamado SAIBK y se detectó la recombinación entre SAIBK y algunos IBVs previamente reportados. Se utilizó una rápida amplificación del kit de extremos de ADNc (RACE) (TaKaRa, Japón) para obtener los extremos 5= y 3= del genoma. Otras partes fueron amplificadas por 19 imprimaciones con solapamiento entre cada fragmento y fueron clonadas en el vector pMD19-T (TaKaRa, Japón). Todos los fragmentos fueron secuenciados tres veces por Sangon Biotech (Shanghai, China). Los fragmentos secuenciados fueron ensamblados usando el programa de software SeqMan (DNAStar, Inc.). Se realizó la alineación de secuencias y se construyó un árbol filogenético usando el programa de software MEGA5 (7). El análisis de recombinación fue realizado usando los programas de software RDP 4.14 (8) y SimPlot 3.5.1 (9). El genoma completo de la cepa SAIBK es 27.534 nucleótidos (nt) de longitud, incluyendo la cola poli(A). Tiene una organización clásica del genoma del IBV con 10 marcos de lectura abiertos (ORFs): La secuencia del genoma del SAIBK muestra la identidad más alta (94,3%) a la cepa china del IBV SC021202 (adhesión GenBank no. EU714029) y la identidad más baja (85,8%) a dos cepas chinas del IBV, BJ (adhesión GenBank no. AY319651) y DY07 (adhesión GenBank no. HM245923). Tiene identidades nucleótidas más bajas de 88,1%, 87,9% y 87,7% a las cepas de vacuna del IBV más utilizadas, H120, H52 y M41, respectivamente. El análisis filogenético de los resultados del genoma completo indicó que el SAIBK se agrupa en la misma rama que la cepa del IBV YN (adhesión Gen La subunidad S1 del genoma del IBV es el principal determinante del serotipo (10) (11) (12) (13) y el análisis S1 indicó que la cepa SAIBK tiene un serotipo similar a 4/91. Los métodos de detección de recombinación empleados revelaron que el SAIBK es un virus de la quimera, con la recombinación por la cepa SC021202 como padre principal y la cepa vacunal H120 como padre menor. La primera y la segunda regiones de recombinación se localizaron en las posiciones 7231 a 9126 y 13437 a 14473 en los genes 1a y 1b, respectivamente. Se detectaron otras dos regiones de recombinación en las posiciones 951 a 1067 y 5393 a 5605 de SAIBK, que fueron recombinadas con la cepa SC021202 como madre principal y la cepa vacunal H52 como madre menor. Los resultados de la detección de recombinación sugieren que SAIBK es posiblemente un virus de la quimera derivado de las cepas vacunales H120 y H52 de uso popular y la cepa de campo SC021202, y la cepa SC021202 fue aislada de pollos vacunados con H120 en la provincia de Sichuan en China en 2003 (14). Este resultado reveló que el campo IBV en la provincia de Sichuan ha sido sometido a recombinación genética y posiblemente está surgiendo como nuevas cepas mutantes, como SAIBK. Número de adhesión de secuencia de nucleotida. La secuencia completa del genoma del aislado SAIB
|
¿Cuánto tiempo dura el gen SAIBK?
| false
| 1,622
|
{
"text": [
"27,534 nucleotides"
],
"answer_start": [
1847
]
}
|
27.534 nucleótidos
|
1,547
|
Secuencia completa del genoma de una cepa del virus de la bronquitis infecciosa nefropatía aislada en Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3795213/SHA: f2df4fc3c60338755fd23da3d7e01c0455e20745Autores: Yang, Jing-tian; Ma, Bing-cunFecha: 2013-10DOI: 10.1128/genomea.0081-13Licencia: cc-byAbstract: El virus de la bronquitis infecciosa (IBV) causa enormes pérdidas económicas a la industria avícola. Texto: enfermedad tagiosa y aguda en pollos domésticos, pertenece al grupo III del género Coronavirus en la familia Coronaviridae (1). Es un virus de ARN (ssRNA) envuelto, no segmentado, de sentido positivo y de una sola cadena y tiene un genoma de aproximadamente 27,6 kb (2). Recientemente, muchos informes de análisis epidemiológicos han sugerido que las IBV nefropatógenas se han vuelto cada vez más frecuentes (3) (4) (5) (6) en China. En este trabajo, se analizó la secuencia completa del genoma de un aislado llamado SAIBK y se detectó la recombinación entre SAIBK y algunos IBVs previamente reportados. Se utilizó una rápida amplificación del kit de extremos de ADNc (RACE) (TaKaRa, Japón) para obtener los extremos 5= y 3= del genoma. Otras partes fueron amplificadas por 19 imprimaciones con solapamiento entre cada fragmento y fueron clonadas en el vector pMD19-T (TaKaRa, Japón). Todos los fragmentos fueron secuenciados tres veces por Sangon Biotech (Shanghai, China). Los fragmentos secuenciados fueron ensamblados usando el programa de software SeqMan (DNAStar, Inc.). Se realizó la alineación de secuencias y se construyó un árbol filogenético usando el programa de software MEGA5 (7). El análisis de recombinación fue realizado usando los programas de software RDP 4.14 (8) y SimPlot 3.5.1 (9). El genoma completo de la cepa SAIBK es 27.534 nucleótidos (nt) de longitud, incluyendo la cola poli(A). Tiene una organización clásica del genoma del IBV con 10 marcos de lectura abiertos (ORFs): La secuencia del genoma del SAIBK muestra la identidad más alta (94,3%) a la cepa china del IBV SC021202 (adhesión GenBank no. EU714029) y la identidad más baja (85,8%) a dos cepas chinas del IBV, BJ (adhesión GenBank no. AY319651) y DY07 (adhesión GenBank no. HM245923). Tiene identidades nucleótidas más bajas de 88,1%, 87,9% y 87,7% a las cepas de vacuna del IBV más utilizadas, H120, H52 y M41, respectivamente. El análisis filogenético de los resultados del genoma completo indicó que el SAIBK se agrupa en la misma rama que la cepa del IBV YN (adhesión Gen La subunidad S1 del genoma del IBV es el principal determinante del serotipo (10) (11) (12) (13) y el análisis S1 indicó que la cepa SAIBK tiene un serotipo similar a 4/91. Los métodos de detección de recombinación empleados revelaron que el SAIBK es un virus de la quimera, con la recombinación por la cepa SC021202 como padre principal y la cepa vacunal H120 como padre menor. La primera y la segunda regiones de recombinación se localizaron en las posiciones 7231 a 9126 y 13437 a 14473 en los genes 1a y 1b, respectivamente. Se detectaron otras dos regiones de recombinación en las posiciones 951 a 1067 y 5393 a 5605 de SAIBK, que fueron recombinadas con la cepa SC021202 como madre principal y la cepa vacunal H52 como madre menor. Los resultados de la detección de recombinación sugieren que SAIBK es posiblemente un virus de la quimera derivado de las cepas vacunales H120 y H52 de uso popular y la cepa de campo SC021202, y la cepa SC021202 fue aislada de pollos vacunados con H120 en la provincia de Sichuan en China en 2003 (14). Este resultado reveló que el campo IBV en la provincia de Sichuan ha sido sometido a recombinación genética y posiblemente está surgiendo como nuevas cepas mutantes, como SAIBK. Número de adhesión de secuencia de nucleotida. La secuencia completa del genoma del aislado SAIB
|
¿Cuántos marcos de lectura abiertos hay en el gen SAIBK?
| false
| 1,623
|
{
"text": [
"10"
],
"answer_start": [
1958
]
}
|
10
|
1,547
|
Secuencia completa del genoma de una cepa del virus de la bronquitis infecciosa nefropatía aislada en Chinahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3795213/SHA: f2df4fc3c60338755fd23da3d7e01c0455e20745Autores: Yang, Jing-tian; Ma, Bing-cunFecha: 2013-10DOI: 10.1128/genomea.0081-13Licencia: cc-byAbstract: El virus de la bronquitis infecciosa (IBV) causa enormes pérdidas económicas a la industria avícola. Texto: enfermedad tagiosa y aguda en pollos domésticos, pertenece al grupo III del género Coronavirus en la familia Coronaviridae (1). Es un virus de ARN (ssRNA) envuelto, no segmentado, de sentido positivo y de una sola cadena y tiene un genoma de aproximadamente 27,6 kb (2). Recientemente, muchos informes de análisis epidemiológicos han sugerido que las IBV nefropatógenas se han vuelto cada vez más frecuentes (3) (4) (5) (6) en China. En este trabajo, se analizó la secuencia completa del genoma de un aislado llamado SAIBK y se detectó la recombinación entre SAIBK y algunos IBVs previamente reportados. Se utilizó una rápida amplificación del kit de extremos de ADNc (RACE) (TaKaRa, Japón) para obtener los extremos 5= y 3= del genoma. Otras partes fueron amplificadas por 19 imprimaciones con solapamiento entre cada fragmento y fueron clonadas en el vector pMD19-T (TaKaRa, Japón). Todos los fragmentos fueron secuenciados tres veces por Sangon Biotech (Shanghai, China). Los fragmentos secuenciados fueron ensamblados usando el programa de software SeqMan (DNAStar, Inc.). Se realizó la alineación de secuencias y se construyó un árbol filogenético usando el programa de software MEGA5 (7). El análisis de recombinación fue realizado usando los programas de software RDP 4.14 (8) y SimPlot 3.5.1 (9). El genoma completo de la cepa SAIBK es 27.534 nucleótidos (nt) de longitud, incluyendo la cola poli(A). Tiene una organización clásica del genoma del IBV con 10 marcos de lectura abiertos (ORFs): La secuencia del genoma del SAIBK muestra la identidad más alta (94,3%) a la cepa china del IBV SC021202 (adhesión GenBank no. EU714029) y la identidad más baja (85,8%) a dos cepas chinas del IBV, BJ (adhesión GenBank no. AY319651) y DY07 (adhesión GenBank no. HM245923). Tiene identidades nucleótidas más bajas de 88,1%, 87,9% y 87,7% a las cepas de vacuna del IBV más utilizadas, H120, H52 y M41, respectivamente. El análisis filogenético de los resultados del genoma completo indicó que el SAIBK se agrupa en la misma rama que la cepa del IBV YN (adhesión Gen La subunidad S1 del genoma del IBV es el principal determinante del serotipo (10) (11) (12) (13) y el análisis S1 indicó que la cepa SAIBK tiene un serotipo similar a 4/91. Los métodos de detección de recombinación empleados revelaron que el SAIBK es un virus de la quimera, con la recombinación por la cepa SC021202 como padre principal y la cepa vacunal H120 como padre menor. La primera y la segunda regiones de recombinación se localizaron en las posiciones 7231 a 9126 y 13437 a 14473 en los genes 1a y 1b, respectivamente. Se detectaron otras dos regiones de recombinación en las posiciones 951 a 1067 y 5393 a 5605 de SAIBK, que fueron recombinadas con la cepa SC021202 como madre principal y la cepa vacunal H52 como madre menor. Los resultados de la detección de recombinación sugieren que SAIBK es posiblemente un virus de la quimera derivado de las cepas vacunales H120 y H52 de uso popular y la cepa de campo SC021202, y la cepa SC021202 fue aislada de pollos vacunados con H120 en la provincia de Sichuan en China en 2003 (14). Este resultado reveló que el campo IBV en la provincia de Sichuan ha sido sometido a recombinación genética y posiblemente está surgiendo como nuevas cepas mutantes, como SAIBK. Número de adhesión de secuencia de nucleotida. La secuencia completa del genoma del aislado SAIB
|
¿Qué virus tiene la identidad genética más cercana con el gen SAIBK?
| false
| 1,624
|
{
"text": [
"Chinese IBV strain SC021202"
],
"answer_start": [
2061
]
}
|
China IBV cepa SC021202
|
187
|
Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 ([email protected]).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo
|
¿Cuántas máscaras quirúrgicas o respiradores han proyectado estudios anteriores serán necesarios para una pandemia en los Estados Unidos?
| false
| 257
|
{
"text": [
"an estimated 7.3 billion"
],
"answer_start": [
6383
]
}
|
un estimado de 7.300 millones
|
187
|
Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 ([email protected]).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo
|
¿Cuál es el acrónimo MERS-CoV?
| false
| 248
|
{
"text": [
"Middle East respiratory syndrome coronavirus"
],
"answer_start": [
722
]
}
|
Síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus
|
187
|
Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 ([email protected]).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo
|
¿Cuáles son los factores críticos que determinan el efecto de una epidemia?
| false
| 249
|
{
"text": [
"Transmissibility and severity"
],
"answer_start": [
474
]
}
|
Transmisibilidad y gravedad
|
187
|
Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 ([email protected]).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo
|
¿Cuándo declaró oficialmente la Organización Mundial de la Salud (OMS) la epidemia de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional?
| false
| 250
|
{
"text": [
"January 30, 2020"
],
"answer_start": [
7759
]
}
|
30 de enero de 2020
|
187
|
Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 ([email protected]).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo
|
¿Qué virus de la gripe se identificó en China en 2013?
| false
| 251
|
{
"text": [
"H7N9"
],
"answer_start": [
5591
]
}
|
H7N9
|
187
|
Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 ([email protected]).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo
|
¿Qué investigaciones anteriores se han hecho sobre pandemias graves de una sola onda?
| false
| 252
|
{
"text": [
"After a new influenza virus (H7N9) was identified in China in 2013, a series of modeling articles described the effect of, and level of preparedness for, a severe, single-wave pandemic in the United States."
],
"answer_start": [
5562
]
}
|
Después de identificarse un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de una sola onda en los Estados Unidos.
|
187
|
Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 ([email protected]).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo
|
¿Qué es una tasa de ataque clínico?
| false
| 253
|
{
"text": [
"the proportion of individuals who become ill with or die from a disease in a population initially uninfected"
],
"answer_start": [
5816
]
}
|
la proporción de personas que se enferman o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada
|
187
|
Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 ([email protected]).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo
|
¿Cuál fue la tasa de ataque clínico en la pandemia H1N1 de 2009?
| false
| 254
|
{
"text": [
"20%"
],
"answer_start": [
5985
]
}
|
20%
|
187
|
Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 ([email protected]).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo
|
¿Cuál es el R0 estimado de COVID-19?
| false
| 255
|
{
"text": [
"2.2"
],
"answer_start": [
7158
]
}
|
2.2
|
187
|
Preparación para la posible transmisión sostenida de la novela Coronavirus 2019Lecciones de epidemiologías anterioreshttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285Febrero 11, 2020David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Afiliations Article InformationJAMA. 2020;323(12):1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.19660COVID-19 Resource CenterIcono de artículos relacionados RelatedArtículosIcono de entrevista del autor EntrevistasAudio Entrevista (25:53)COVID-19 Actualización Desde ChinaTransmisibilidad y severidad son los 2 factores más críticos que determinan el efecto de una epidemia. Ni la pandemia del virus de la gripe pandémica A(H1N1) ([H1N1]pdm09) ni el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) o la epidemia del síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV) tuvieron la combinación de alta transmisibilidad y severidad. Las estrategias de control son impulsadas por esta combinación. R0, el número de reproducción básica, es una medida de transmisibilidad comúnmente utilizada y se define como el número de personas adicionales que un caso infecta durante el curso de su enfermedad. Un R0 de menos de 1 indica que la infección morirá “eventualmente”. Un R0 de mayor de 1 indica que la infección tiene el potencial de transmisión sostenida. Por ejemplo, influenza A(H1N1)pdm09, identificada por primera vez en el sur de California el 15 de abril de 2009, fue muy transmisible. Para el 5 de mayo de 2009, la gripe A(H1N1)pdm09 se había propagado a 41 Estados Unidos y 21 países.1 Aunque la gripe A(H1N1)pdm09 era muy transmisible, no era grave. Las estimaciones iniciales de la R0 de la gripe A(H1N1)pdm09 fueron 1,7.2 Aunque se estima que hubo 201 200 muertes respiratorias por gripe A(H1N1)pdm09 durante el primer año de la pandemia, el número de muertes por población fue 30 veces menor que el observado durante la pandemia de gripe de 1968, 1000 veces menor que la pandemia de 1918 e incluso menos que las epidemias estacionales típicas de gripe (estimadas por la Organización Mundial de la Salud [OMS] en 250 000 a 500 000 por año, aunque los métodos de estimación difieren).3 La gripe A(H1N1)pdm09 fue muy transmisible El SARS-CoV (2003) y el MERS-CoV (2012-corriente) causan enfermedades graves, pero a pesar de las estimaciones iniciales de R0 de más de 2,0 para el SARS-CoV (que indican una transmisión sostenida e incluso mundial), y algunos brotes grandes, tampoco fueron tan transmisibles como se sugirió inicialmente. El SARS-CoV causó 8098 casos notificados y 774 muertes (tasa de mortalidad por caso, 9,6%) en 37 países antes de que se controlara la epidemia. Se consideró que el control había sido posible porque una alta proporción de los casos eran graves, lo que facilitaba la identificación y el aislamiento rápidos de las personas infectadas. Además, el virus estaba presente en niveles más bajos en las secreciones de las vías aéreas superiores. No hubo transmisión secundaria en los Estados Unidos de los 8 casos importados, aunque en Toronto (Canadá) se cree que una sola importación ha provocado alrededor de 400 casos y 44 Las estimaciones posteriores de R0 fueron inferiores a 1, lo que indica que el SARS-CoV puede no haber sido capaz de transmitirse de forma sostenida, especialmente en el establecimiento de medidas de control4.Similarmente, el MERS-CoV parece tener alta severidad y poca transmisibilidad.Desde 2012, el MERS-CoV ha causado 2494 casos notificados y 858 muertes (tasa de mortalidad por caso, 34%) en 27 países.El MERS-CoV también ha causado algunos brotes rápidos, principalmente en hospitales de Arabia Saudita, Jordania y Corea del Sur, pero las estimaciones del MERS-CoV R0 son inferiores a 1, y hasta ahora se ha contenido5. En preparación para una pandemia de gripe, el Plan Pandemic Influenza del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos incluyó una combinación de intervenciones no farmacéuticas (cierre de fronteras y escuelas, medidas de control de infecciones) y farmacéuticas (profilaxis antiviral, vacunas) destinadas a ser utilizadas en combinación para interrumpir o ralentizar la transmisión de la gripe. A pesar de la implementación de algunas de estas intervenciones, la gripe A(H1N1)pdm09 se extendió a 120 países en 3 meses. Con la aparición del MERS-CoV en el Medio Oriente, se elaboró un plan de preparación que incluyó un plan de vigilancia, pruebas de laboratorio y guía de rastreo de contactos. Se elaboraron directrices de control de infecciones para su uso en entornos de atención de la salud y se elaboró orientación para el viajero para el público6. No se identificaron casos secundarios en los Estados Unidos. Se consideró que el MERS-CoV era grave y las medidas de control se basaban en el reconocimiento de los casos sospechosos. Sin embargo, durante un brote hospitalario en Jeddah, Arabia Saudita, entre los pacientes hospitalizados sólo 5 de 53 (9%) casos asociados a la atención médica tenían presencia documentada en la misma habitación que un paciente con MERS5. A pesar de la alta tasa de mortalidad (una medida importante de gravedad), los casos de MERS pueden ser asintomáticos y leves (25% en un brote). Aunque no se sabe con qué frecuencia los pacientes asintomáticos o levemente sintomáticos transmiten MERS, iniciar medidas integrales como aislar a los pacientes sospechosos de haber estado expuestos al virus o haber estado expuestos a él y utilizar equipos de protección personal cuando se cuidan de ellos puede ser extremadamente difícil porque muchos pacientes tienen síntomas leves y no específicos. ¿Está el mundo listo para un virus Después de que se identificara un nuevo virus de la gripe (H7N9) en China en 2013, una serie de artículos de modelización describieron el efecto y el nivel de preparación para una pandemia grave de onda única en los Estados Unidos.7 En los escenarios que utilizaron tasas de ataque clínico (la proporción de personas que se enferman con una enfermedad o mueren de una enfermedad en una población inicialmente no infectada) del 20% al 30% (en comparación, la tasa de ataque clínico fue del 20% en el primer año de la pandemia de 2009 de H1N1), dependiendo de la gravedad se estima que habría entre 669 000 y 4,3 millones de hospitalizaciones y entre 54 000 y 538 000 muertes sin intervención alguna en los Estados Unidos. Los modelos sugerían que, sin una vacuna, los cierres escolares no serían probables para afectar a la pandemia, se necesitarían entre 35 000 y 60 000 ventiladores, se necesitarían hasta unos 7 300 millones de máscaras quirúrgicas o respiradores, y quizás lo más importante, si el desarrollo de la vacuna no comenzara antes de la introducción del virus, era poco probable que se pudiera evitar un número significativo de hospitalizaciones y muertes debido al tiempo que lleva desarrollar, probar, fabricar y distribuir una vacuna. Es imposible saber qué ocurrirá tan pronto en esta nueva epidemia de coronavirus 2019 (2019-nCoV). El alcance, la morbilidad y la mortalidad dependerán de la combinación de gravedad y transmisibilidad. Numerosos expertos han “casticado” cuántos casos han ocurrido y pronosticado cuántos casos probablemente ocurrirán. Un estudio reciente sugiere que la transmisión rápida de persona a persona puede ocurrir.8 Los modeladores de enfermedades han estimado que R0 es 2.2.9 La Universidad de Hong Kong estima que el brote podría infectar a más de 150 000 personas al día en China en su pico. ¿Es grave la infección por COV 2019-n? Hasta la fecha, aproximadamente el 14% de los casos de COV 2019-n han sido descritos como graves por la OMS, con una tasa de mortalidad por caso del 2,1%.10 Las estimaciones de gravedad son generalmente más altas al comienzo de una epidemia debido a la identificación de los casos más gravemente afectados y la disminución a medida que la epidemia progresa. Sin embargo, debido a que muchas personas infectadas aún no se han recuperado y pueden morir, la tasa de mortalidad por caso y gravedad podrían subestimarse. En la preparación para una posible transmisión sostenida de 2019-nCoV más allá de China, se deben considerar cuidadosamente las lecciones aplicables de experiencias previas con epidemias/pandemias de virus respiratorios para controlar y mitigar las posibles consecuencias. Se han desarrollado planes de preparación para la gripe que tienen como objetivo detener, frenar o limitar la propagación de una pandemia de gripe a los Estados Unidos. Estos planes abordan la limitación de la propagación doméstica y la mitigación de enfermedades, pero también el mantenimiento de la infraestructura y la reducción de los efectos adversos de la pandemia en la economía y la sociedad. Estos planes serían útiles para promulgar durante la epidemia de 2019-nCoV si los Estados Unidos experimentan una transmisión sostenida. Los países han tenido éxito en el pasado y todavía no hay nada que predecir que esta vez sea más probable. La prevención y el control eficaces no serán fáciles si hay transmisión sostenida y requerirán la plena atención de la salud pública, los gobiernos federal y local, el sector privado y Volver al principioInformación del artículoAutor para correspondencia: David L. Swerdlow, MD, Clinical Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 ([email protected]).Publicado en línea: 11 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1960Conflicto de intereses Divulgaciones: El Dr. Swerdlow informa que posee acciones y opciones de acciones en Pfizer Inc. El Dr. Swerdlow también informa que proporciona una consulta única consistente en una visión general de la epidemiología de SARS y MERS a GLG Consulting y recibe un honorario. Rol of the Funder/Sponsor: Pfizer Inc revisó el manuscrito y aprobó la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Referencias1. Swerdlow DL, Finelli L, Bridges CB. 2009 H1N1 pandemia de gripe: campo y investigaciones epidemiológicas en los Estados Unidos al comienzo de la primera pandemia del siglo XXI. Clin Infect Dis. 2011;52(suppl 1):S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2. Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Potencial de transmisión estacional y picos de actividad de la nueva gripe A(H1N1): un análisis de probabilidad de Monte Carlo basado en la movilidad humana. BMC Medicine. 2009;7(45). doi:10.1186/1741-7015-75-453. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Mortalidad global estimada asociada a los primeros 12 meses de la circulación del virus de la gripe pandémica A H1N1 de 2009: un estudio de modelización. Lancet Infect Dis. 2012;12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4. Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Parámetros modelo y control de brotes para SRAS. Emerg Infect Dis. 2004;10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedogle ScholarCrossref5. Killer Emerg Infect Dis. 2020;26(2):191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6. Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Microbiol Spectr. 2016;4(3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020/2016PubMedGoogle Scholar7. Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. CDC modelando esfuerzos en respuesta a una posible emergencia de salud pública: influenza A(H7N9) como ejemplo. Clin Infect Dis. 2015;60(suppl):S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8. Wang D, Hu B, Hu C, et al. Características clínicas de 138 pacientes hospitalizados con nueva neumonía infectada por coronavirus 2019 en Wuhan, China. JAMA. Publicado en línea el 7 de febrero de 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArtículoPubMedGoogle Scholar9. Li Q, Guan X, Wu P, et al. Dinámica de transmisión temprana en Wuhan, China, de nueva neumonía infectada por coronavirus. N Engl J Med. Publicado en línea el 29 de enero de 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10. Organización Mundial de la Salud. Novel coronavirus (2019-nCoV) informes de situación https://www.who.int/emergencies/ diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Accessed February 4, 2020. Comment2 Comments for this articleEXPAND ALLFebruary 12, 2020Entender la R y el control de enfermedadesOz Mansoor Public Health Physician, WellingtonEl mensaje, que necesitamos prepararnos para una pandemia es vital. Pero el artículo no reporta algunas ideas clave. En primer lugar, el SRAS no fue controlado "porque una alta proporción de casos eran graves". Aunque eso ayudó, fue porque los casos no eran infecciosos antes de algunos días después de la aparición de los síntomas (generalmente en la segunda semana de enfermedad), lo que dio más tiempo para la identificación y el aislamiento de los casos. Y la mayoría de los casos no transmitieron infección a nadie, Desafortunadamente, el nuevo virus parece estar extendiéndose de las personas mucho antes en el curso de la enfermedad, e incluso con síntomas leves - que nunca fue documentado para el SARS. Sin embargo, no está claro que sea diferente o mejor en la propagación entre las personas, y tal vez con el mismo patrón de la mayoría de los casos no causando mayor propagación. En segundo lugar, el R0, el número de reproducción básica, se describe correctamente como el número medio de infecciones causa cada caso. Pero carece de dos ideas clave: 1) el 0 después de la R implica el estado nativo, que es una población totalmente susceptible y sin ninguna medida de control. R es el número efectivo y puede incluir el impacto de las medidas de control. Afirmar que fue la falta de transmisibilidad, en lugar de las medidas de control que terminaron con el SARS, no se basa en ninguna evidencia. E ignora los esfuerzos heroicos de los países afectados. La eliminación del SARS demostró el potencial de la acción colectiva coordinada globalmente, así como el daño causado por la ignorancia y los prejuicios.La mayoría parece haber olvidado ya las lecciones del SARS.CONFLICTO DE INTERÉS: Trabajado para la OMS/WPRO en respuesta al SARSREAD MÁSFebrero 24, 2020COVID 19: ¿una presencia global y no sólo un nuevo patógeno? Giuliano Ramadori, Profesor de Medicina Clínica Universitaria, Göttingen, AlemaniaEn la temporada de invierno llega el momento de las infecciones del tracto respiratorio superior e inferior caracterizadas por tos, disnea y eventualmente fiebre (enfermedad similar a la gripe).Algunos de los pacientes, especialmente las personas mayores que viven solas afectadas por la enfermedad, pueden necesitar hospitalización y eventualmente cuidados intensivos.En muchos de los casos se examina el líquido nasal y/o traqueal hospitalizado para detectar agentes virales o bacteria Sólo en menos del 50% de los casos se considera que el virus de la gripe es la causa de la enfermedad.En el resto de los casos el procedimiento de diagnóstico de coronavirus humanos no se realiza de forma rutinaria.Uno de los cuatro Coronavirus humanos diferentes (HuCoV: 229E,NL 63,0C43 y HKU1) se puede encontrar en hasta el 30% de los pacientes negativos para virus de la gripe (1). Científicos chinos en Wuhan, que tuvieron que hacer frente a un número creciente de enfermedades agudas de las vías respiratorias que se asemejan a neumonía viral, realizaron un análisis de secuenciación profunda a partir de muestras tomadas del tracto respiratorio inferior y encontraron un coronavirus "novela".La secuencia del genoma completo se hizo pública.Sin embargo, al mismo tiempo, Wuhan trajo a la atención las epidemias SARS y MERS.Las medidas adoptadas por las autoridades chinas y OMS son ahora bien conocidas. Recientemente se han identificado cerca de 150 nuevos casos en el norte de Italia y las autoridades sanitarias siguen buscando el caso 0 (la fuente). ¿Es posible que COVID-19 ya existiera en Italia -- y no sólo en Italia, sino posiblemente en todo el mundo -- y que la nueva secuencia de nucleótidos disponible permita ahora encontrar la causa de una enfermedad similar a la gripe sin definir previamente? REFERENCE1. Benezit F et al. INFECCIÓN, 13 de febrero de 2020, https://doi.org/101007/s15010-019-01388-1).CONFLICT OF INTEREST: Ninguno ReportedREAD MORESee More AboutGlobal Health Public Health Pulmonary Medicine Infectious Diseases InfluenzaDownload PDFCite ThisPermissionsCommentCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning have multimediaUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil LibertiesMarzo 24, 2020Opinion is learning has multimedia2019 Novel Coronavirus—Novel Coronavirus—Información importante para los médicosMarzo 17, 2020Investigación es un aprendizaje multimediaLas características legales de los pacientes con la infección Coronavirus (2019-nCoV) Hospitalizada en Beijing Todos los derechos reservados. Términos de uso Política de privacidad Declaración de accesibilidadSilverchair Logo
|
¿Cuántos ventiladores han proyectado estudios anteriores serán necesarios para una pandemia en los Estados Unidos?
| false
| 1,657
|
{
"text": [
"35 000 to 60 000"
],
"answer_start": [
6331
]
}
|
35 000 a 60 000
|
1,582
|
El muestreo de condensados respiratorios exhalados no es un nuevo método para la detección de virus respiratorioshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3059288/SHA: f3b46e7e8f58799207cc44515f859c1daf5e4dfcAutores: Houspie, Lieselot; De Coster, Sarah; Keyaerts, Els; Narongsack, Phouthalack; De Roy, Rikka; Talboom, Ive; Sisk, Maura; Maes, Piet; Verbeeck, Jannick; Van Ranst, MarcFecha: 2011-03-04DOI: 10.1186/1743-422x-8-98Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRADO: El muestreo MÉTODOS: En nuestro estudio se reclutaron 102 voluntarios con infección de la vía aérea superior durante el invierno y principios de la primavera de 2008/2009 y la primera mitad del invierno de 2009/2010. Se obtuvieron con éxito 99 EBCs y se examinaron 14 virus respiratorios de circulación frecuente. Para investigar la eficiencia del aislamiento del virus del EBC, se tomó un hisopo nasal en paralelo de un subconjunto de voluntarios. El uso combinado del dispositivo ECoVent con el RTubeTM permitió registrar el volumen exhalado y la frecuencia respiratoria durante la recolección. De esta manera, se puede estimar teóricamente el número de partículas virales exhaladas por litro de aire o por minuto. RESULTADOS: El cribado viral resultó en la detección de 4 virus diferentes en EBC y/o hisopos nasales: Rhinovirus, Virus Sincitial Respiratorio Humano B, Influenza A e Influenza B. Rhinovirus fue detectado en 6 EBCs y 1 EBC fue Influenza B positivo. Se reporta una tasa de detección viral del 7% para los EBCs, que es mucho menor que la tasa de detección del 46,8% observada con hisopos nasales. CONCLUSIÓN: Aunque muy prometedora, la recolección de EBC utilizando el RPubeTM no es confiable para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Texto: Las infecciones respiratorias humanas representan las infecciones más frecuentemente encontradas en todo el mundo. En la mayoría de los casos, la etiología de estas infecciones sigue siendo indeterminada debido a la rápida convalecencia después de la infección. Las infecciones del tracto respiratorio en adultos sanos pueden ser causadas por una variedad de patógenos y la detección de estos agentes se basa actualmente en su aislamiento de hisopos nasales (NS), lavados broncoalveolares (BAL), aspirados nasofaríngeos y muestras de esputo. La adquisición de estos especímenes mediante técnicas semi-invasoras e invasivas es a menudo desagradable para el paciente. Por lo tanto, el análisis de condensado de aliento exhalado (EBC) se ha explorado recientemente como un método nuevo y no invasivo para monitorear la inflamación pulmonar y la enfermedad pulmonar como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, fibrosis quística, cáncer de pulmón, etc. Los CEM consisten principalmente en vapor de agua, pero una pequeña fracción contiene gotitas respiratorias derivadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias [1, 2]. Esta observación ha generado un creciente interés en el uso de EBC como nuevo método de muestreo para el cribado de virus respiratorios que infectan las vías aéreas superiores. Al principio, los investigadores sospecharon que la turbulencia del aire inhalado era responsable de la aerosolización del líquido respiratorio. Sin embargo, el efecto del flujo turbulento de aire se limita a las vías aéreas superiores, ya que el flujo turbulento de aire se vuelve laminar a medida que llega a las vías aéreas bronquiales más pequeñas y los alvéolos. Recientemente, se ha descrito el modelo de explosión de la película de líquido bronquiol [3]. Este modelo sugiere que los aerosoles se producen durante la inhalación por el estallido de burbujas de líquido presentes en los bronquiolos. El objetivo de este estudio fue investigar si el método de recolección de EBC fue adecuado para la condensación eficiente de partículas de virus aerosolizados durante la respiración normal En este estudio, se recogieron 102 EBC de voluntarios sanos que mostraban síntomas respiratorios o gripales (definidos en la Tabla 1), utilizando un condensador disponible comercialmente (RTubeTM, Respiratory Research Inc., Charlottesville, Virginia, EE.UU.). Se instruyó al paciente a respirar por vía oral a volúmenes de mareas en una boquilla conectada a un condensador durante 10 minutos. No se utilizaron clips nasales durante la recolección y se evitó la contaminación salival por la presencia de una válvula de un solo sentido y la sección en forma de T de la boquilla. En una primera parte del estudio que se inició durante el invierno y la primavera de 2008/2009, se recogieron 70 muestras de EBC de pacientes que voluntariamente se presentaron a nuestro laboratorio. La mayoría de estos voluntarios fueron estudiantes que respondieron al folleto informativo, distribuido en los edificios universitarios de la Universidad Católica de Leuven. En el otoño y la primera mitad del invierno de 2009/2010, se recogieron 32 condensados de pacientes que se presentaron a su médico general. Debido a circunstancias prácticas, los condensados se recolectaron con el refrigerador refrigerado a -20°C. Para 13 de las 32 colecciones, el RUBETM fue conectado por un conector hecho a medida al ECoVent (Jaeger, Alemania). Este dispositivo registra parámetros ventilatorios como el volumen exhalado, la frecuencia respiratoria y el volumen de mareas. Además, se obtuvo un NS en paralelo con la colección de condensados de cada paciente. Todos los EBC se almacenaron inmediatamente a -20°C. Se refrigeraron los hisopos nasales (NS). Después de la extracción de ADN y ARN virales, se almacenaron muestras de EBC y toallitas nasales a -80°C. Se excluyeron del estudio tres especímenes por recolección incorrecta de condensados, se utilizó un breve cuestionario para documentar la fecha de nacimiento, la gravedad de las dolencias respiratorias y para registrar los días de enfermedad sintomática de todos los voluntarios, el cual fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Universitario de Lovaina y se recibieron consentimientos informados de todos los participantes, se aislaron ADN y ARN virales con el kit de virus QIAamp MinElute (Qiagen, Westburg, Países Bajos) de acuerdo con el manual de instrucciones, se eludieron extractos de EBC en tampón de elución de 60 μl y extractos de NS en tampón de 110 μl. Los condensados respiratorios fueron analizados para detectar 11 virus del ARN respiratorio (CoV NL63, E229 y OC43, RV, HMPV, InfA&B y PIV1-4) [4] [5] [6] [7] utilizando un kit de RCR-RT de OneStep (Qiagen, Westburg, Países Bajos) en una reacción de 50 μl que contenía 10 μl de ARN extraído, 0,6 μM de imprimaciones hacia adelante e inversas (Tabla 2), 1,5 μl de Enzima de One Step, 10 μl 5 × Un tampón de RT-PCR de One Step y 400 μM de cada dNTP. Para el cribado de adenovirus, se realizó un PCR de ADN para el cual la mezcla de reacción de amplificación contenía 0,5 μM de imprimación delantera (AdFW) e imprimación inversa (AdRV), 0,4 mM dNTPs, 10 μl Buffer C y 1 U Taq polimerasa en un volumen final de 50 μl. Los imprimadores PCR utilizados se localizaron en regiones conservadas de los genomas de los patógenos respiratorios (Tabla 2 ). Las reacciones se realizaron en un Termociclista T3000 48 (Westburg, Leusden, Países Bajos) con un paso inicial de transcripción inversa para virus ARN a 50 °C durante 30 min, seguido de activación PCR a 95 °C durante 30 s, 45 ciclos de amplificación seguidos de un paso final de extensión durante 10 min a 72 °C. El programa de amplificación del ADN se inició con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 3 minutos, seguido de 45 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Los amplicones fueron sometidos a un gel de poliacrilamida del 6% y visualizados bajo luz UV por tinción con bromuro de etidium. Los productos PCR fueron purificados utilizando el Kit Invitado MSB Spin PCRapace y el ciclo secuenciado en dirección delantera e inversa utilizando el kit de secuenciación de ciclos de terminación de Big-Dye ABI PRISM (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, USA). El análisis de secuencias se realizó con el Analizador Genético ABI3130 (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, EE.UU En resumen, se preparó una mezcla múltiplex en un volumen final de 25 μl utilizando ARN extraído de 5 μl, 12,5 μl de Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR Master Mix que contiene ROX como referencia pasiva, 0,125 μl Euroscript + RT & Rnasa inhibidor (Eurogentec, Seraing, Bélgica) 200 nM de HRSV-A y -B imprimadores delanteros e inversos específicos y 100 nM de HRSV-A y -B MGB. Los estándares de ARNc se construyeron utilizando el kit T7 de shortscript MEGA (Ambión, Austin, TX, EE.UU.) y cuantificado espectrométricamente. La carga viral de muestras positivas de RV fue cuantificada por qRT-PCR como se describe en el manuscrito publicado por Lu y compañeros [10]. El kit Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR fue utilizado para la preparación de la mezcla maestra como se describe anteriormente. El primer HRSV-AF F 669-695 ctgtgatagarttcaacaaaagaaca [8, 9] HRSV-AF F 718-745 agttacaccttcattaactaaatcc [8, 9] HRSV-BN N 435-458 ggctccagaatatagggattc [8, 9] HRSV-BN N 480-508 tggttattacaagaagagcactacagagt [8, 9] MGB sondas y sondas, situadas en 5'UTR, se añadieron a una concentración final de 1 μM y 0,1 μM, respectivamente. Los estándares de ARNc se construyeron sobre la base del producto PCR de la muestra 1 utilizando el kit MegaScript (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). La cuantificación se realizó con un espectrofotómetro a 260 nm y se convirtió al número de molécula [11]. Se realizaron diluciones en serie de diez veces, lo que permitió la detección en un rango de 8,6 × 10 6 a 8,6 × 10 2 copias de ARN. Los ensayos RT-PCR se realizaron en un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7500 (Aplicado Biosistemas, Foster City, CA, EE.UU.). Se realizó un paso inicial de transcripción inversa a 48°C durante 30 minutos, seguido de un paso de desnaturalización a 95°C durante 10 minutos. Finalmente, se completó un paso de amplificación de 45 cicli a 95°C durante 15 segundos y 1 min a 60°C. (37,5%) hombres, con mediana de edad de 29 años (rango 9 -46 años). Faltaron edad y género para 2 participantes del segundo Sólo el 6% eran menores de 20 años y el 3% tenían más de 70 años; en total, 80 pacientes (78,4%) ya se encontraban enfermos durante 1 a 7 días en el día de la obtención de la muestra; siete voluntarios (6,8%) eran sintomáticos durante 8 a 14 días y 9 participantes (8,8%) ya estaban enfermos durante más de 14 días en el día de la recogida de la muestra; faltaban datos sobre la duración de los síntomas en 6 pacientes; casi todos los voluntarios experimentaron al menos 2 síntomas, excepto en dos pacientes (Tabla 1); cuarenta y siete (46,1%) voluntarios se quejaron de una constante secreción nasal o congestión nasal, 43 (42,2%) tuvieron frecuentes episodios de estornudos y 38 (37,3%) tuvieron dolor de garganta grave (Tabla 1). El cribado de los EBC para 14 virus respiratorios (Tabla 2), mostró 5 muestras positivas de RV (7,1%) (Tabla 3). En una segunda parte, se recolectaron 32 EBC de pacientes que se presentaron a su médico general; dos de estos EBC fueron positivos para uno de los 14 virus respiratorios investigados, 1 para RV y 1 para InfB. Para inspeccionar la tasa de detección de virus respiratorios en el condensado, se tomó un NS de este segundo grupo de voluntarios para la comparación. En 15 de los 32 NS (46,8%), uno o más patógenos virales fueron aislados. El cribado viral del NS resultó en la detección de RV, InfA (subtipo H1N1) y HRSV-B. La cuantificación de la carga viral HRSV-B demostrada para las muestras 72 y 101 títulos virales de 8,0 × 10 4 copias de ARN/ml y 6,8 × 10 7 copias de ARN/ml respectivamente. El ensayo RV RT-PCR no permitió la cuantificación de todas las muestras que dieron positivo para RV por PCR (Tabla 3). La presencia del mismo patógeno tanto en el EBC como en el NS fue confirmada para una sola muestra: muestra 71, que dio positivo para RV tanto en el EBC como en el NS. Para la muestra 81, se detectó RV en el NS y el análisis del EBC demostró una infección por InfB. Para las muestras de EBC que fueron recogidas en otoño e invierno de 2009/2010, las mediciones con el EcoVent en (Tabla 3, muestra 81) fueron positivas para InfB cuando se utilizó el RTube En teoría, la tasa de generación viral (número de copias de ARN viral exhaladas por minuto) se puede predecir mediante la cuantificación de la carga viral exhalada. Luego, se puede calcular una estimación de las copias de ARN por litro de aire exhalado o por minuto. La cuantificación del InfB exhalado nos permitiría predecir la tasa de generación de este virus. Debido a un volumen de muestra insuficiente, no pudimos determinar el número de copias de ARN en la muestra. La recolección de condensados de aliento exhalados es un método novedoso y no invasivo para obtener muestras del tracto respiratorio superior. La recolección de EBC es fácil de realizar y se puede llevar a cabo en un ambiente doméstico. Este método es mucho más agradable para el paciente cuando se compara con la recolección desagradable e invasiva de hisopos nasales, BAL, aspirados, etc. Este aspecto hace que el método sea muy atractivo para diagnósticos de laboratorio rutina La mayoría de los estudios que realizan análisis de aliento para la detección viral utilizan máscaras faciales modificadas, con una región central extraíble en electret o un filtro de teflón extraíble en el que las partículas exhaladas impactan [12] [13] [14]. Con el dispositivo de recolección de RTubeTM, las partículas aerosolizadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias se precipitan en un condensado cuando se enfría la respiración, lo que sirve como punto de partida inmediato para las pruebas moleculares. Hasta ahora, este es el estudio con el subconjunto más grande de voluntarios que investigó la EBC como muestra para la detección de virus respiratorios. Estudios anteriores reportaron la inclusión de un subconjunto limitado de participantes e investigaron la presencia de un número limitado de virus en las muestras de aliento. El estudio realizado por Fabian y colegas, incluyó 12 voluntarios [12]. Huynh y compañeros de trabajo reclutaron a 9 voluntarios En el estudio de Stelzer-Braid et al., se analizaron 50 EBCs [14] y St-George et al. reportaron la participación de 12 adultos [15]. Estos estudios se han centrado en la detección de InfA y -B, PIV1-3, HRSV y HMPV, mientras que hemos examinado las muestras para un panel de 14 virus respiratorios que circulan comúnmente. Basados en el análisis de 99 EBCs (3 EBCs fueron excluidos), nuestros resultados apoyan la exhalación de RV e InfB en el 7% de nuestras muestras. Dado que muchos de los voluntarios ya habían estado experimentando síntomas durante 1 a 7 días, inicialmente presumimos que ya se estaban recuperando de la infección y ya no estaban exhalando el virus. Sin embargo, en una segunda parte de nuestro estudio comenzamos a recolectar los CNE en paralelo con hisopos nasales de pacientes que se presentaban a su médico, 1 a 3 días después de la aparición de los síntomas; sólo se detectó 1 condensado del mismo patógeno tanto en el CNE como en el NS; la tasa de detección de patógenos virales respiratorios en el NS fue de 46,8%, muy superior a la tasa de detección del 7% en los CNE; por lo tanto, la baja detección de condensados positivos del virus no se puede atribuir al hecho de que los voluntarios ya no eran infecciosos; la tasa de detección discrepante entre muestras también puede explicarse por la diferente gravedad de la infección respiratoria, ya que las muestras de comparador eran de diferentes partes del tracto respiratorio; los pacientes que presentaron un NS positivo podrían haber sufrido una infección de vía aérea superior, mientras que los voluntarios positivos del CNE pueden haber Sin embargo, no se investigó el efecto de la inhalación nasal en la recolección de CNE, guiando partículas formadas en el tracto respiratorio superior a los compartimentos inferiores, en lugar de la inhalación oral, los pacientes con muestras positivas de CNE experimentaron síntomas durante un máximo de dos días en el momento de la recolección, sin embargo, esto no fue diferente en 7 pacientes con SNE positivo. Seis pacientes que proporcionaron SNE positivo experimentaron síntomas durante un período más largo en el momento de la recolección (Tabla 3 ). En el grupo de voluntarios que proporcionaron una muestra de CNE negativo o CNE y SNE negativo, la manifestación de síntomas fue reportada de 1 día a más de dos semanas. Cuando se compararon los síntomas reportados entre los pacientes positivos de CNE (7) y los pacientes positivos de SNE (15), el 27% y el 33% en el grupo positivo de SNE experimentaron escalofríos y dolor muscular En todos los grupos se reportaron fiebre, cefalea, ojos llorosos, nariz rellena, estornudos frecuentes, dolor de garganta y tos; no se diagnosticó a los voluntarios con otros patógenos antes de la participación en el estudio; ya que no probamos estas muestras para otros que no sean patógenos virales, no podemos excluir la posibilidad de que algunos de los NS negativos sean positivos para bacterias u otros patógenos causantes de enfermedades respiratorias; recientemente, un estudio reportó una tasa de detección del 5% para la gripe en el EBC [15] ; esto se encuentra en el mismo rango de la tasa de detección que reportamos para virus respiratorios en general; otros estudios con un número limitado de pacientes, describen una sensibilidad marcadamente mayor del 33 al 36% [12] [13] [14] pero el mayor porcentaje puede deberse al bajo número de sujetos participantes [12]. Las máscaras faciales consisten en electret que atrapan virus a base de fibras permanentemente cargadas [13]. Además, el filtro de Teflon tiene 2 μm poros que retienen todas las partículas más grandes. Posiblemente, la menor tasa de detección puede explicarse en parte por el hecho de que el RTubeTM está fabricado en polipropileno y no posee una característica de atracción y filtrado de virus como los materiales mencionados. El qRT-PCR desarrollado por Lu y colaboradores para la detección de RV, no permitió la evaluación de la carga viral presente en las muestras de EBC [10]. También para 4 NS, el título viral permaneció indeterminado, probablemente debido a la sensibilidad limitada del ensayo. Para el diagnóstico, podrían ser necesarios métodos más sensibles para detectar virus respiratorios presentes en EBC, ya que es impredecible cómo se diluyen las partículas virales en el espécimen. Recientemente, se han desarrollado ensayos de qRT-PCR anidados para permitir una detección más sensible de virus en aerosoles [16]. También se ha sugerido que los factores dependientes de la persona, como el número de partículas producidas, el volumen exhalado y la edad del paciente, desempeñan un papel importante para la exhalación de partículas virales. Los participantes que fueron reclutados en el estudio de Fabian y compañeros de trabajo tenían 12 años de edad y más [12]. Para los niños hospitalizados se reporta una tasa mucho más alta de muestras positivas del virus [14]. En nuestro estudio, la mayoría de los voluntarios tenían entre 20 y 30 años de edad. Sólo se incluyeron dos niños menores de 10 años y 3 ancianos (> 70 años de edad). Uno de los niños dio positivo para InfA en el NS, pero la infección no fue confirmada en el EBC. Para la gripe, se previó una tasa de generación exhalada de <3,2 a 20 copias de ARN de gripe por minuto, cuantificando los aerosoles del virus que impactaron en un filtro extraíble de Teflon de una máscara de recolección [12]. Utilizamos el RTubeTM en combinación con el ECoVent, que permitió el registro de parámetros de ventilación adicionales como frecuencia respiratoria y volumen exhalado. De esta manera, cuando se cuantifica el número de copias de ARN en el EBC, se puede estimar la cantidad de partículas virales que se exhalan por litro o por minuto. Lamentablemente, no pudimos predecir una tasa de generación de virus para InfB ya que la carga viral permaneció indeterminada. Aunque un método innovador, nuevo y prometedor, el EBC recogido por el RTubeTM no parece apropiado para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Esta técnica también confirma la observación de que los virus son capaces de diseminarse a través de la respiración normal, particularmente RV. Además, se puede investigar más a fondo la recolección de glóbulos rojos de los pacientes durante las infecciones respiratorias para determinar los patrones de biomarcadores. En terneros infectados experimentalmente con VRS bovina, se observó un aumento en el leucotrieno B 4, lo que indica estrés oxidativo; este aumento también se asoció con el desarrollo de hiperrespuesta bronquial [17]. En humanos, se observó un nivel de H 2 O 2 transitoriamente elevado durante la infección por resfriado común; este marcador volvió a los valores basales cuando los voluntarios se recuperaron de la infección; H 2 O 2 también ha sido reconocido como un marcador interesante en asma, donde se asocia con inflamación crónica de las vías respiratorias inferiores [18]. En voluntarios infectados por InfA, se observó un aumento del CO durante la infección respiratoria Esta observación podría implicar que el CO es un indicador de inflamación de la vía aérea o representa uno de los mecanismos de defensa del huésped contra la infección viral [19]. Por lo tanto, una mejor identificación de la firma del biomarcador en condensados de individuos que experimentan una infección viral podría implicar hallazgos interesantes hacia la identificación de marcadores que reflejan la inflamación o protección antiviral, lo que puede contribuir a los perfiles de biomarcadores establecidos para enfermedades como asma y EPOC, para las cuales se sugiere que las infecciones virales desencadenan o exacerban síntomas [20].
|
¿Cómo se utiliza el condensado exhalado de la respiración en la investigación viral?
| false
| 5,193
|
{
"text": [
"the isolation of respiratory viruses"
],
"answer_start": [
548
]
}
|
aislamiento de virus respiratorios
|
1,582
|
El muestreo de condensados respiratorios exhalados no es un nuevo método para la detección de virus respiratorioshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3059288/SHA: f3b46e7e8f58799207cc44515f859c1daf5e4dfcAutores: Houspie, Lieselot; De Coster, Sarah; Keyaerts, Els; Narongsack, Phouthalack; De Roy, Rikka; Talboom, Ive; Sisk, Maura; Maes, Piet; Verbeeck, Jannick; Van Ranst, MarcFecha: 2011-03-04DOI: 10.1186/1743-422x-8-98Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRADO: El muestreo MÉTODOS: En nuestro estudio se reclutaron 102 voluntarios con infección de la vía aérea superior durante el invierno y principios de la primavera de 2008/2009 y la primera mitad del invierno de 2009/2010. Se obtuvieron con éxito 99 EBCs y se examinaron 14 virus respiratorios de circulación frecuente. Para investigar la eficiencia del aislamiento del virus del EBC, se tomó un hisopo nasal en paralelo de un subconjunto de voluntarios. El uso combinado del dispositivo ECoVent con el RTubeTM permitió registrar el volumen exhalado y la frecuencia respiratoria durante la recolección. De esta manera, se puede estimar teóricamente el número de partículas virales exhaladas por litro de aire o por minuto. RESULTADOS: El cribado viral resultó en la detección de 4 virus diferentes en EBC y/o hisopos nasales: Rhinovirus, Virus Sincitial Respiratorio Humano B, Influenza A e Influenza B. Rhinovirus fue detectado en 6 EBCs y 1 EBC fue Influenza B positivo. Se reporta una tasa de detección viral del 7% para los EBCs, que es mucho menor que la tasa de detección del 46,8% observada con hisopos nasales. CONCLUSIÓN: Aunque muy prometedora, la recolección de EBC utilizando el RPubeTM no es confiable para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Texto: Las infecciones del tracto respiratorio humano representan las infecciones más frecuentemente encontradas en todo el mundo. En la mayoría de los casos, la etiología de estas infecciones sigue siendo indeterminada debido a la rápida convalecencia después de la infección. Las infecciones del tracto respiratorio en adultos sanos pueden ser causadas por una variedad de patógenos y la detección de estos agentes se basa actualmente en su aislamiento de hisopos nasales (NS), lavados broncoalveolares (BAL), aspirados nasofaríngeos y muestras de esputo. La adquisición de estos especímenes mediante técnicas semi-invasoras e invasivas es a menudo desagradable para el paciente. Por lo tanto, el análisis de condensado de aliento exhalado (EBC) se ha explorado recientemente como un método nuevo y no invasivo para monitorear la inflamación pulmonar y la enfermedad pulmonar como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, fibrosis quística, cáncer de pulmón, etc. Los CEM consisten principalmente en vapor de agua, pero una pequeña fracción contiene gotitas respiratorias derivadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias [1, 2]. Esta observación ha generado un creciente interés en el uso de EBC como nuevo método de muestreo para el cribado de virus respiratorios que infectan las vías aéreas superiores. Al principio, los investigadores sospecharon que la turbulencia del aire inhalado era responsable de la aerosolización del líquido respiratorio. Sin embargo, el efecto del flujo turbulento de aire se limita a las vías aéreas superiores, ya que el flujo turbulento de aire se vuelve laminar a medida que llega a las vías aéreas bronquiales más pequeñas y los alvéolos. Recientemente, se ha descrito el modelo de explosión de la película de líquido bronquiol [3]. Este modelo sugiere que los aerosoles se producen durante la inhalación por el estallido de burbujas de líquido presentes en los bronquiolos. El objetivo de este estudio fue investigar si el método de recolección de EBC fue adecuado para la condensación eficiente de partículas de virus aerosolizados durante la respiración normal En este estudio, se recogieron 102 EBC de voluntarios sanos que mostraban síntomas respiratorios o gripales (definidos en la Tabla 1), utilizando un condensador disponible comercialmente (RTubeTM, Respiratory Research Inc., Charlottesville, Virginia, EE.UU.). Se instruyó al paciente a respirar por vía oral a volúmenes de mareas en una boquilla conectada a un condensador durante 10 minutos. No se utilizaron clips nasales durante la recolección y se evitó la contaminación salival por la presencia de una válvula de un solo sentido y la sección en forma de T de la boquilla. En una primera parte del estudio que se inició durante el invierno y la primavera de 2008/2009, se recogieron 70 muestras de EBC de pacientes que voluntariamente se presentaron a nuestro laboratorio. La mayoría de estos voluntarios fueron estudiantes que respondieron al folleto informativo, distribuido en los edificios universitarios de la Universidad Católica de Leuven. En el otoño y la primera mitad del invierno de 2009/2010, se recogieron 32 condensados de pacientes que se presentaron a su médico general. Debido a circunstancias prácticas, los condensados se recolectaron con el refrigerador refrigerado a -20°C. Para 13 de las 32 colecciones, el RUBETM fue conectado por un conector hecho a medida al ECoVent (Jaeger, Alemania). Este dispositivo registra parámetros ventilatorios como el volumen exhalado, la frecuencia respiratoria y el volumen de mareas. Además, se obtuvo un NS en paralelo con la colección de condensados de cada paciente. Todos los EBC se almacenaron inmediatamente a -20°C. Se refrigeraron los hisopos nasales (NS). Después de la extracción de ADN y ARN virales, se almacenaron muestras de EBC y toallitas nasales a -80°C. Se excluyeron del estudio tres especímenes por recolección incorrecta de condensados, se utilizó un breve cuestionario para documentar la fecha de nacimiento, la gravedad de las dolencias respiratorias y para registrar los días de enfermedad sintomática de todos los voluntarios, el cual fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Universitario de Lovaina y se recibieron consentimientos informados de todos los participantes, se aislaron ADN y ARN virales con el kit de virus QIAamp MinElute (Qiagen, Westburg, Países Bajos) de acuerdo con el manual de instrucciones, se eludieron extractos de EBC en tampón de elución de 60 μl y extractos de NS en tampón de 110 μl. Los condensados respiratorios fueron analizados para detectar 11 virus del ARN respiratorio (CoV NL63, E229 y OC43, RV, HMPV, InfA&B y PIV1-4) [4] [5] [6] [7] utilizando un kit de RCR-RT de OneStep (Qiagen, Westburg, Países Bajos) en una reacción de 50 μl que contenía 10 μl de ARN extraído, 0,6 μM de imprimaciones hacia adelante e inversas (Tabla 2), 1,5 μl de Enzima de One Step, 10 μl 5 × Un tampón de RT-PCR de One Step y 400 μM de cada dNTP. Para el cribado de adenovirus, se realizó un PCR de ADN para el cual la mezcla de reacción de amplificación contenía 0,5 μM de imprimación delantera (AdFW) e imprimación inversa (AdRV), 0,4 mM dNTPs, 10 μl Buffer C y 1 U Taq polimerasa en un volumen final de 50 μl. Los imprimadores PCR utilizados se localizaron en regiones conservadas de los genomas de los patógenos respiratorios (Tabla 2 ). Las reacciones se realizaron en un Termociclista T3000 48 (Westburg, Leusden, Países Bajos) con un paso inicial de transcripción inversa para virus ARN a 50 °C durante 30 min, seguido de activación PCR a 95 °C durante 30 s, 45 ciclos de amplificación seguidos de un paso final de extensión durante 10 min a 72 °C. El programa de amplificación del ADN se inició con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 3 minutos, seguido de 45 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Los amplicones fueron sometidos a un gel de poliacrilamida del 6% y visualizados bajo luz UV por tinción con bromuro de etidium. Los productos PCR fueron purificados utilizando el Kit Invitado MSB Spin PCRapace y el ciclo secuenciado en dirección delantera e inversa utilizando el kit de secuenciación de ciclos de terminación de Big-Dye ABI PRISM (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, USA). El análisis de secuencias se realizó con el Analizador Genético ABI3130 (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, EE.UU En resumen, se preparó una mezcla múltiplex en un volumen final de 25 μl utilizando ARN extraído de 5 μl, 12,5 μl de Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR Master Mix que contiene ROX como referencia pasiva, 0,125 μl Euroscript + RT & Rnasa inhibidor (Eurogentec, Seraing, Bélgica) 200 nM de HRSV-A y -B imprimadores delanteros e inversos específicos y 100 nM de HRSV-A y -B MGB. Los estándares de ARNc se construyeron utilizando el kit T7 de shortscript MEGA (Ambión, Austin, TX, EE.UU.) y cuantificado espectrométricamente. La carga viral de muestras positivas de RV fue cuantificada por qRT-PCR como se describe en el manuscrito publicado por Lu y compañeros [10]. El kit Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR fue utilizado para la preparación de la mezcla maestra como se describe anteriormente. El primer HRSV-AF F 669-695 ctgtgatagarttcaacaaaagaaca [8, 9] HRSV-AF F 718-745 agttacaccttcattaactaaatcc [8, 9] HRSV-BN N 435-458 ggctccagaatatagggattc [8, 9] HRSV-BN N 480-508 tggttattacaagaagagcactacagagt [8, 9] MGB sondas y sondas, situadas en 5'UTR, se añadieron a una concentración final de 1 μM y 0,1 μM, respectivamente. Los estándares de ARNc se construyeron sobre la base del producto PCR de la muestra 1 utilizando el kit MegaScript (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). La cuantificación se realizó con un espectrofotómetro a 260 nm y se convirtió al número de molécula [11]. Se realizaron diluciones en serie de diez veces, lo que permitió la detección en un rango de 8,6 × 10 6 a 8,6 × 10 2 copias de ARN. Los ensayos RT-PCR se realizaron en un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7500 (Aplicado Biosistemas, Foster City, CA, EE.UU.). Se realizó un paso inicial de transcripción inversa a 48°C durante 30 minutos, seguido de un paso de desnaturalización a 95°C durante 10 minutos. Finalmente, se completó un paso de amplificación de 45 cicli a 95°C durante 15 segundos y 1 min a 60°C. (37,5%) hombres, con mediana de edad de 29 años (rango 9 -46 años). Faltaron edad y género para 2 participantes del segundo Sólo el 6% eran menores de 20 años y el 3% tenían más de 70 años; en total, 80 pacientes (78,4%) ya se encontraban enfermos durante 1 a 7 días en el día de la obtención de la muestra; siete voluntarios (6,8%) eran sintomáticos durante 8 a 14 días y 9 participantes (8,8%) ya estaban enfermos durante más de 14 días en el día de la recogida de la muestra; faltaban datos sobre la duración de los síntomas en 6 pacientes; casi todos los voluntarios experimentaron al menos 2 síntomas, excepto en dos pacientes (Tabla 1); cuarenta y siete (46,1%) voluntarios se quejaron de una constante secreción nasal o congestión nasal, 43 (42,2%) tuvieron frecuentes episodios de estornudos y 38 (37,3%) tuvieron dolor de garganta grave (Tabla 1). El cribado de los EBC para 14 virus respiratorios (Tabla 2), mostró 5 muestras positivas de RV (7,1%) (Tabla 3). En una segunda parte, se recolectaron 32 EBC de pacientes que se presentaron a su médico general; dos de estos EBC fueron positivos para uno de los 14 virus respiratorios investigados, 1 para RV y 1 para InfB. Para inspeccionar la tasa de detección de virus respiratorios en el condensado, se tomó un NS de este segundo grupo de voluntarios para la comparación. En 15 de los 32 NS (46,8%), uno o más patógenos virales fueron aislados. El cribado viral del NS resultó en la detección de RV, InfA (subtipo H1N1) y HRSV-B. La cuantificación de la carga viral HRSV-B demostrada para las muestras 72 y 101 títulos virales de 8,0 × 10 4 copias de ARN/ml y 6,8 × 10 7 copias de ARN/ml respectivamente. El ensayo RV RT-PCR no permitió la cuantificación de todas las muestras que dieron positivo para RV por PCR (Tabla 3). La presencia del mismo patógeno tanto en el EBC como en el NS fue confirmada para una sola muestra: muestra 71, que dio positivo para RV tanto en el EBC como en el NS. Para la muestra 81, se detectó RV en el NS y el análisis del EBC demostró una infección por InfB. Para las muestras de EBC que fueron recogidas en otoño e invierno de 2009/2010, las mediciones con el EcoVent en (Tabla 3, muestra 81) fueron positivas para InfB cuando se utilizó el RTube En teoría, la tasa de generación viral (número de copias de ARN viral exhaladas por minuto) se puede predecir mediante la cuantificación de la carga viral exhalada. Luego, se puede calcular una estimación de las copias de ARN por litro de aire exhalado o por minuto. La cuantificación del InfB exhalado nos permitiría predecir la tasa de generación de este virus. Debido a un volumen de muestra insuficiente, no pudimos determinar el número de copias de ARN en la muestra. La recolección de condensados de aliento exhalados es un método novedoso y no invasivo para obtener muestras del tracto respiratorio superior. La recolección de EBC es fácil de realizar y se puede llevar a cabo en un ambiente doméstico. Este método es mucho más agradable para el paciente cuando se compara con la recolección desagradable e invasiva de hisopos nasales, BAL, aspirados, etc. Este aspecto hace que el método sea muy atractivo para diagnósticos de laboratorio rutina La mayoría de los estudios que realizan análisis de aliento para la detección viral utilizan máscaras faciales modificadas, con una región central extraíble en electret o un filtro de teflón extraíble en el que las partículas exhaladas impactan [12] [13] [14]. Con el dispositivo de recolección de RTubeTM, las partículas aerosolizadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias se precipitan en un condensado cuando se enfría la respiración, lo que sirve como punto de partida inmediato para las pruebas moleculares. Hasta ahora, este es el estudio con el subconjunto más grande de voluntarios que investigó la EBC como muestra para la detección de virus respiratorios. Estudios anteriores reportaron la inclusión de un subconjunto limitado de participantes e investigaron la presencia de un número limitado de virus en las muestras de aliento. El estudio realizado por Fabian y colegas, incluyó 12 voluntarios [12]. Huynh y compañeros de trabajo reclutaron a 9 voluntarios En el estudio de Stelzer-Braid et al., se analizaron 50 EBCs [14] y St-George et al. reportaron la participación de 12 adultos [15]. Estos estudios se han centrado en la detección de InfA y -B, PIV1-3, HRSV y HMPV, mientras que hemos examinado las muestras para un panel de 14 virus respiratorios que circulan comúnmente. Basados en el análisis de 99 EBCs (3 EBCs fueron excluidos), nuestros resultados apoyan la exhalación de RV e InfB en el 7% de nuestras muestras. Dado que muchos de los voluntarios ya habían estado experimentando síntomas durante 1 a 7 días, inicialmente presumimos que ya se estaban recuperando de la infección y ya no estaban exhalando el virus. Sin embargo, en una segunda parte de nuestro estudio comenzamos a recolectar los CNE en paralelo con hisopos nasales de pacientes que se presentaban a su médico, 1 a 3 días después de la aparición de los síntomas; sólo se detectó 1 condensado del mismo patógeno tanto en el CNE como en el NS; la tasa de detección de patógenos virales respiratorios en el NS fue de 46,8%, muy superior a la tasa de detección del 7% en los CNE; por lo tanto, la baja detección de condensados positivos del virus no se puede atribuir al hecho de que los voluntarios ya no eran infecciosos; la tasa de detección discrepante entre muestras también puede explicarse por la diferente gravedad de la infección respiratoria, ya que las muestras de comparador eran de diferentes partes del tracto respiratorio; los pacientes que presentaron un NS positivo podrían haber sufrido una infección de vía aérea superior, mientras que los voluntarios positivos del CNE pueden haber Sin embargo, no se investigó el efecto de la inhalación nasal en la recolección de CNE, guiando partículas formadas en el tracto respiratorio superior a los compartimentos inferiores, en lugar de la inhalación oral, los pacientes con muestras positivas de CNE experimentaron síntomas durante un máximo de dos días en el momento de la recolección, sin embargo, esto no fue diferente en 7 pacientes con SNE positivo. Seis pacientes que proporcionaron SNE positivo experimentaron síntomas durante un período más largo en el momento de la recolección (Tabla 3 ). En el grupo de voluntarios que proporcionaron una muestra de CNE negativo o CNE y SNE negativo, la manifestación de síntomas fue reportada de 1 día a más de dos semanas. Cuando se compararon los síntomas reportados entre los pacientes positivos de CNE (7) y los pacientes positivos de SNE (15), el 27% y el 33% en el grupo positivo de SNE experimentaron escalofríos y dolor muscular En todos los grupos se reportaron fiebre, cefalea, ojos llorosos, nariz rellena, estornudos frecuentes, dolor de garganta y tos; no se diagnosticó a los voluntarios con otros patógenos antes de la participación en el estudio; ya que no probamos estas muestras para otros que no sean patógenos virales, no podemos excluir la posibilidad de que algunos de los NS negativos sean positivos para bacterias u otros patógenos causantes de enfermedades respiratorias; recientemente, un estudio reportó una tasa de detección del 5% para la gripe en el EBC [15] ; esto se encuentra en el mismo rango de la tasa de detección que reportamos para virus respiratorios en general; otros estudios con un número limitado de pacientes, describen una sensibilidad marcadamente mayor del 33 al 36% [12] [13] [14] pero el mayor porcentaje puede deberse al bajo número de sujetos participantes [12]. Las máscaras faciales consisten en electret que atrapan virus a base de fibras permanentemente cargadas [13]. Además, el filtro de Teflon tiene 2 μm poros que retienen todas las partículas más grandes. Posiblemente, la menor tasa de detección puede explicarse en parte por el hecho de que el RTubeTM está fabricado en polipropileno y no posee una característica de atracción y filtrado de virus como los materiales mencionados. El qRT-PCR desarrollado por Lu y colaboradores para la detección de RV, no permitió la evaluación de la carga viral presente en las muestras de EBC [10]. También para 4 NS, el título viral permaneció indeterminado, probablemente debido a la sensibilidad limitada del ensayo. Para el diagnóstico, podrían ser necesarios métodos más sensibles para detectar virus respiratorios presentes en EBC, ya que es impredecible cómo se diluyen las partículas virales en el espécimen. Recientemente, se han desarrollado ensayos de qRT-PCR anidados para permitir una detección más sensible de virus en aerosoles [16]. También se ha sugerido que los factores dependientes de la persona, como el número de partículas producidas, el volumen exhalado y la edad del paciente, desempeñan un papel importante para la exhalación de partículas virales. Los participantes que fueron reclutados en el estudio de Fabian y compañeros de trabajo tenían 12 años de edad y más [12]. Para los niños hospitalizados se reporta una tasa mucho más alta de muestras positivas del virus [14]. En nuestro estudio, la mayoría de los voluntarios tenían entre 20 y 30 años de edad. Sólo se incluyeron dos niños menores de 10 años y 3 ancianos (> 70 años de edad). Uno de los niños dio positivo para InfA en el NS, pero la infección no fue confirmada en el EBC. Para la gripe, se previó una tasa de generación exhalada de <3,2 a 20 copias de ARN de gripe por minuto, cuantificando los aerosoles del virus que impactaron en un filtro extraíble de Teflon de una máscara de recolección [12]. Utilizamos el RTubeTM en combinación con el ECoVent, que permitió el registro de parámetros de ventilación adicionales como frecuencia respiratoria y volumen exhalado. De esta manera, cuando se cuantifica el número de copias de ARN en el EBC, se puede estimar la cantidad de partículas virales que se exhalan por litro o por minuto. Lamentablemente, no pudimos predecir una tasa de generación de virus para InfB ya que la carga viral permaneció indeterminada. Aunque un método innovador, nuevo y prometedor, el EBC recogido por el RTubeTM no parece apropiado para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Esta técnica también confirma la observación de que los virus son capaces de diseminarse a través de la respiración normal, particularmente RV. Además, se puede investigar más a fondo la recolección de glóbulos rojos de los pacientes durante las infecciones respiratorias para determinar los patrones de biomarcadores. En terneros infectados experimentalmente con VRS bovina, se observó un aumento en el leucotrieno B 4, lo que indica estrés oxidativo; este aumento también se asoció con el desarrollo de hiperrespuesta bronquial [17]. En humanos, se observó un nivel de H 2 O 2 transitoriamente elevado durante la infección por resfriado común; este marcador volvió a los valores basales cuando los voluntarios se recuperaron de la infección; H 2 O 2 también ha sido reconocido como un marcador interesante en asma, donde se asocia con inflamación crónica de las vías respiratorias inferiores [18]. En voluntarios infectados por InfA, se observó un aumento del CO durante la infección respiratoria Esta observación podría implicar que el CO es un indicador de inflamación de la vía aérea o representa uno de los mecanismos de defensa del huésped contra la infección viral [19]. Por lo tanto, una mejor identificación de la firma del biomarcador en condensados de individuos que experimentan una infección viral podría implicar hallazgos interesantes hacia la identificación de marcadores que reflejan la inflamación o protección antiviral, lo que puede contribuir a los perfiles de biomarcadores establecidos para enfermedades como asma y EPOC, para las cuales se sugiere que las infecciones virales desencadenan o exacerban síntomas [20].
|
¿Cuántos pacientes fui en este estudio?
| false
| 5,194
|
{
"text": [
"102"
],
"answer_start": [
609
]
}
|
102
|
1,582
|
El muestreo de condensados respiratorios exhalados no es un nuevo método para la detección de virus respiratorioshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3059288/SHA: f3b46e7e8f58799207cc44515f859c1daf5e4dfcAutores: Houspie, Lieselot; De Coster, Sarah; Keyaerts, Els; Narongsack, Phouthalack; De Roy, Rikka; Talboom, Ive; Sisk, Maura; Maes, Piet; Verbeeck, Jannick; Van Ranst, MarcFecha: 2011-03-04DOI: 10.1186/1743-422x-8-98Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRADO: El muestreo MÉTODOS: En nuestro estudio se reclutaron 102 voluntarios con infección de la vía aérea superior durante el invierno y principios de la primavera de 2008/2009 y la primera mitad del invierno de 2009/2010. Se obtuvieron con éxito 99 EBCs y se examinaron 14 virus respiratorios de circulación frecuente. Para investigar la eficiencia del aislamiento del virus del EBC, se tomó un hisopo nasal en paralelo de un subconjunto de voluntarios. El uso combinado del dispositivo ECoVent con el RTubeTM permitió registrar el volumen exhalado y la frecuencia respiratoria durante la recolección. De esta manera, se puede estimar teóricamente el número de partículas virales exhaladas por litro de aire o por minuto. RESULTADOS: El cribado viral resultó en la detección de 4 virus diferentes en EBC y/o hisopos nasales: Rhinovirus, Virus Sincitial Respiratorio Humano B, Influenza A e Influenza B. Rhinovirus fue detectado en 6 EBCs y 1 EBC fue Influenza B positivo. Se reporta una tasa de detección viral del 7% para los EBCs, que es mucho menor que la tasa de detección del 46,8% observada con hisopos nasales. CONCLUSIÓN: Aunque muy prometedora, la recolección de EBC utilizando el RPubeTM no es confiable para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Texto: Las infecciones del tracto respiratorio humano representan las infecciones más frecuentemente encontradas en todo el mundo. En la mayoría de los casos, la etiología de estas infecciones sigue siendo indeterminada debido a la rápida convalecencia después de la infección. Las infecciones del tracto respiratorio en adultos sanos pueden ser causadas por una variedad de patógenos y la detección de estos agentes se basa actualmente en su aislamiento de hisopos nasales (NS), lavados broncoalveolares (BAL), aspirados nasofaríngeos y muestras de esputo. La adquisición de estos especímenes mediante técnicas semi-invasoras e invasivas es a menudo desagradable para el paciente. Por lo tanto, el análisis de condensado de aliento exhalado (EBC) se ha explorado recientemente como un método nuevo y no invasivo para monitorear la inflamación pulmonar y la enfermedad pulmonar como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, fibrosis quística, cáncer de pulmón, etc. Los CEM consisten principalmente en vapor de agua, pero una pequeña fracción contiene gotitas respiratorias derivadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias [1, 2]. Esta observación ha generado un creciente interés en el uso de EBC como nuevo método de muestreo para el cribado de virus respiratorios que infectan las vías aéreas superiores. Al principio, los investigadores sospecharon que la turbulencia del aire inhalado era responsable de la aerosolización del líquido respiratorio. Sin embargo, el efecto del flujo turbulento de aire se limita a las vías aéreas superiores, ya que el flujo turbulento de aire se vuelve laminar a medida que llega a las vías aéreas bronquiales más pequeñas y los alvéolos. Recientemente, se ha descrito el modelo de explosión de la película de líquido bronquiol [3]. Este modelo sugiere que los aerosoles se producen durante la inhalación por el estallido de burbujas de líquido presentes en los bronquiolos. El objetivo de este estudio fue investigar si el método de recolección de EBC fue adecuado para la condensación eficiente de partículas de virus aerosolizados durante la respiración normal En este estudio, se recogieron 102 EBC de voluntarios sanos que mostraban síntomas respiratorios o gripales (definidos en la Tabla 1), utilizando un condensador disponible comercialmente (RTubeTM, Respiratory Research Inc., Charlottesville, Virginia, EE.UU.). Se instruyó al paciente a respirar por vía oral a volúmenes de mareas en una boquilla conectada a un condensador durante 10 minutos. No se utilizaron clips nasales durante la recolección y se evitó la contaminación salival por la presencia de una válvula de un solo sentido y la sección en forma de T de la boquilla. En una primera parte del estudio que se inició durante el invierno y la primavera de 2008/2009, se recogieron 70 muestras de EBC de pacientes que voluntariamente se presentaron a nuestro laboratorio. La mayoría de estos voluntarios fueron estudiantes que respondieron al folleto informativo, distribuido en los edificios universitarios de la Universidad Católica de Leuven. En el otoño y la primera mitad del invierno de 2009/2010, se recogieron 32 condensados de pacientes que se presentaron a su médico general. Debido a circunstancias prácticas, los condensados se recolectaron con el refrigerador refrigerado a -20°C. Para 13 de las 32 colecciones, el RUBETM fue conectado por un conector hecho a medida al ECoVent (Jaeger, Alemania). Este dispositivo registra parámetros ventilatorios como el volumen exhalado, la frecuencia respiratoria y el volumen de mareas. Además, se obtuvo un NS en paralelo con la colección de condensados de cada paciente. Todos los EBC se almacenaron inmediatamente a -20°C. Se refrigeraron los hisopos nasales (NS). Después de la extracción de ADN y ARN virales, se almacenaron muestras de EBC y toallitas nasales a -80°C. Se excluyeron del estudio tres especímenes por recolección incorrecta de condensados, se utilizó un breve cuestionario para documentar la fecha de nacimiento, la gravedad de las dolencias respiratorias y para registrar los días de enfermedad sintomática de todos los voluntarios, el cual fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Universitario de Lovaina y se recibieron consentimientos informados de todos los participantes, se aislaron ADN y ARN virales con el kit de virus QIAamp MinElute (Qiagen, Westburg, Países Bajos) de acuerdo con el manual de instrucciones, se eludieron extractos de EBC en tampón de elución de 60 μl y extractos de NS en tampón de 110 μl. Los condensados respiratorios fueron analizados para detectar 11 virus del ARN respiratorio (CoV NL63, E229 y OC43, RV, HMPV, InfA&B y PIV1-4) [4] [5] [6] [7] utilizando un kit de RCR-RT de OneStep (Qiagen, Westburg, Países Bajos) en una reacción de 50 μl que contenía 10 μl de ARN extraído, 0,6 μM de imprimaciones hacia adelante e inversas (Tabla 2), 1,5 μl de Enzima de One Step, 10 μl 5 × Un tampón de RT-PCR de One Step y 400 μM de cada dNTP. Para el cribado de adenovirus, se realizó un PCR de ADN para el cual la mezcla de reacción de amplificación contenía 0,5 μM de imprimación delantera (AdFW) e imprimación inversa (AdRV), 0,4 mM dNTPs, 10 μl Buffer C y 1 U Taq polimerasa en un volumen final de 50 μl. Los imprimadores PCR utilizados se localizaron en regiones conservadas de los genomas de los patógenos respiratorios (Tabla 2 ). Las reacciones se realizaron en un Termociclista T3000 48 (Westburg, Leusden, Países Bajos) con un paso inicial de transcripción inversa para virus ARN a 50 °C durante 30 min, seguido de activación PCR a 95 °C durante 30 s, 45 ciclos de amplificación seguidos de un paso final de extensión durante 10 min a 72 °C. El programa de amplificación del ADN se inició con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 3 minutos, seguido de 45 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Los amplicones fueron sometidos a un gel de poliacrilamida del 6% y visualizados bajo luz UV por tinción con bromuro de etidium. Los productos PCR fueron purificados utilizando el Kit Invitado MSB Spin PCRapace y el ciclo secuenciado en dirección delantera e inversa utilizando el kit de secuenciación de ciclos de terminación de Big-Dye ABI PRISM (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, USA). El análisis de secuencias se realizó con el Analizador Genético ABI3130 (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, EE.UU En resumen, se preparó una mezcla múltiplex en un volumen final de 25 μl utilizando ARN extraído de 5 μl, 12,5 μl de Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR Master Mix que contiene ROX como referencia pasiva, 0,125 μl Euroscript + RT & Rnasa inhibidor (Eurogentec, Seraing, Bélgica) 200 nM de HRSV-A y -B imprimadores delanteros e inversos específicos y 100 nM de HRSV-A y -B MGB. Los estándares de ARNc se construyeron utilizando el kit T7 de shortscript MEGA (Ambión, Austin, TX, EE.UU.) y cuantificado espectrométricamente. La carga viral de muestras positivas de RV fue cuantificada por qRT-PCR como se describe en el manuscrito publicado por Lu y compañeros [10]. El kit Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR fue utilizado para la preparación de la mezcla maestra como se describe anteriormente. El primer HRSV-AF F 669-695 ctgtgatagarttcaacaaaagaaca [8, 9] HRSV-AF F 718-745 agttacaccttcattaactaaatcc [8, 9] HRSV-BN N 435-458 ggctccagaatatagggattc [8, 9] HRSV-BN N 480-508 tggttattacaagaagagcactacagagt [8, 9] MGB sondas y sondas, situadas en 5'UTR, se añadieron a una concentración final de 1 μM y 0,1 μM, respectivamente. Los estándares de ARNc se construyeron sobre la base del producto PCR de la muestra 1 utilizando el kit MegaScript (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). La cuantificación se realizó con un espectrofotómetro a 260 nm y se convirtió al número de molécula [11]. Se realizaron diluciones en serie de diez veces, lo que permitió la detección en un rango de 8,6 × 10 6 a 8,6 × 10 2 copias de ARN. Los ensayos RT-PCR se realizaron en un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7500 (Aplicado Biosistemas, Foster City, CA, EE.UU.). Se realizó un paso inicial de transcripción inversa a 48°C durante 30 minutos, seguido de un paso de desnaturalización a 95°C durante 10 minutos. Finalmente, se completó un paso de amplificación de 45 cicli a 95°C durante 15 segundos y 1 min a 60°C. (37,5%) hombres, con mediana de edad de 29 años (rango 9 -46 años). Faltaron edad y género para 2 participantes del segundo Sólo el 6% eran menores de 20 años y el 3% tenían más de 70 años; en total, 80 pacientes (78,4%) ya se encontraban enfermos durante 1 a 7 días en el día de la obtención de la muestra; siete voluntarios (6,8%) eran sintomáticos durante 8 a 14 días y 9 participantes (8,8%) ya estaban enfermos durante más de 14 días en el día de la recogida de la muestra; faltaban datos sobre la duración de los síntomas en 6 pacientes; casi todos los voluntarios experimentaron al menos 2 síntomas, excepto en dos pacientes (Tabla 1); cuarenta y siete (46,1%) voluntarios se quejaron de una constante secreción nasal o congestión nasal, 43 (42,2%) tuvieron frecuentes episodios de estornudos y 38 (37,3%) tuvieron dolor de garganta grave (Tabla 1). El cribado de los EBC para 14 virus respiratorios (Tabla 2), mostró 5 muestras positivas de RV (7,1%) (Tabla 3). En una segunda parte, se recolectaron 32 EBC de pacientes que se presentaron a su médico general; dos de estos EBC fueron positivos para uno de los 14 virus respiratorios investigados, 1 para RV y 1 para InfB. Para inspeccionar la tasa de detección de virus respiratorios en el condensado, se tomó un NS de este segundo grupo de voluntarios para la comparación. En 15 de los 32 NS (46,8%), uno o más patógenos virales fueron aislados. El cribado viral del NS resultó en la detección de RV, InfA (subtipo H1N1) y HRSV-B. La cuantificación de la carga viral HRSV-B demostrada para las muestras 72 y 101 títulos virales de 8,0 × 10 4 copias de ARN/ml y 6,8 × 10 7 copias de ARN/ml respectivamente. El ensayo RV RT-PCR no permitió la cuantificación de todas las muestras que dieron positivo para RV por PCR (Tabla 3). La presencia del mismo patógeno tanto en el EBC como en el NS fue confirmada para una sola muestra: muestra 71, que dio positivo para RV tanto en el EBC como en el NS. Para la muestra 81, se detectó RV en el NS y el análisis del EBC demostró una infección por InfB. Para las muestras de EBC que fueron recogidas en otoño e invierno de 2009/2010, las mediciones con el EcoVent en (Tabla 3, muestra 81) fueron positivas para InfB cuando se utilizó el RTube En teoría, la tasa de generación viral (número de copias de ARN viral exhaladas por minuto) se puede predecir mediante la cuantificación de la carga viral exhalada. Luego, se puede calcular una estimación de las copias de ARN por litro de aire exhalado o por minuto. La cuantificación del InfB exhalado nos permitiría predecir la tasa de generación de este virus. Debido a un volumen de muestra insuficiente, no pudimos determinar el número de copias de ARN en la muestra. La recolección de condensados de aliento exhalados es un método novedoso y no invasivo para obtener muestras del tracto respiratorio superior. La recolección de EBC es fácil de realizar y se puede llevar a cabo en un ambiente doméstico. Este método es mucho más agradable para el paciente cuando se compara con la recolección desagradable e invasiva de hisopos nasales, BAL, aspirados, etc. Este aspecto hace que el método sea muy atractivo para diagnósticos de laboratorio rutina La mayoría de los estudios que realizan análisis de aliento para la detección viral utilizan máscaras faciales modificadas, con una región central extraíble en electret o un filtro de teflón extraíble en el que las partículas exhaladas impactan [12] [13] [14]. Con el dispositivo de recolección de RTubeTM, las partículas aerosolizadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias se precipitan en un condensado cuando se enfría la respiración, lo que sirve como punto de partida inmediato para las pruebas moleculares. Hasta ahora, este es el estudio con el subconjunto más grande de voluntarios que investigó la EBC como muestra para la detección de virus respiratorios. Estudios anteriores reportaron la inclusión de un subconjunto limitado de participantes e investigaron la presencia de un número limitado de virus en las muestras de aliento. El estudio realizado por Fabian y colegas, incluyó 12 voluntarios [12]. Huynh y compañeros de trabajo reclutaron a 9 voluntarios En el estudio de Stelzer-Braid et al., se analizaron 50 EBCs [14] y St-George et al. reportaron la participación de 12 adultos [15]. Estos estudios se han centrado en la detección de InfA y -B, PIV1-3, HRSV y HMPV, mientras que hemos examinado las muestras para un panel de 14 virus respiratorios que circulan comúnmente. Basados en el análisis de 99 EBCs (3 EBCs fueron excluidos), nuestros resultados apoyan la exhalación de RV e InfB en el 7% de nuestras muestras. Dado que muchos de los voluntarios ya habían estado experimentando síntomas durante 1 a 7 días, inicialmente presumimos que ya se estaban recuperando de la infección y ya no estaban exhalando el virus. Sin embargo, en una segunda parte de nuestro estudio comenzamos a recolectar los CNE en paralelo con hisopos nasales de pacientes que se presentaban a su médico, 1 a 3 días después de la aparición de los síntomas; sólo se detectó 1 condensado del mismo patógeno tanto en el CNE como en el NS; la tasa de detección de patógenos virales respiratorios en el NS fue de 46,8%, muy superior a la tasa de detección del 7% en los CNE; por lo tanto, la baja detección de condensados positivos del virus no se puede atribuir al hecho de que los voluntarios ya no eran infecciosos; la tasa de detección discrepante entre muestras también puede explicarse por la diferente gravedad de la infección respiratoria, ya que las muestras de comparador eran de diferentes partes del tracto respiratorio; los pacientes que presentaron un NS positivo podrían haber sufrido una infección de vía aérea superior, mientras que los voluntarios positivos del CNE pueden haber Sin embargo, no se investigó el efecto de la inhalación nasal en la recolección de CNE, guiando partículas formadas en el tracto respiratorio superior a los compartimentos inferiores, en lugar de la inhalación oral, los pacientes con muestras positivas de CNE experimentaron síntomas durante un máximo de dos días en el momento de la recolección, sin embargo, esto no fue diferente en 7 pacientes con SNE positivo. Seis pacientes que proporcionaron SNE positivo experimentaron síntomas durante un período más largo en el momento de la recolección (Tabla 3 ). En el grupo de voluntarios que proporcionaron una muestra de CNE negativo o CNE y SNE negativo, la manifestación de síntomas fue reportada de 1 día a más de dos semanas. Cuando se compararon los síntomas reportados entre los pacientes positivos de CNE (7) y los pacientes positivos de SNE (15), el 27% y el 33% en el grupo positivo de SNE experimentaron escalofríos y dolor muscular En todos los grupos se reportaron fiebre, cefalea, ojos llorosos, nariz rellena, estornudos frecuentes, dolor de garganta y tos; no se diagnosticó a los voluntarios con otros patógenos antes de la participación en el estudio; ya que no probamos estas muestras para otros que no sean patógenos virales, no podemos excluir la posibilidad de que algunos de los NS negativos sean positivos para bacterias u otros patógenos causantes de enfermedades respiratorias; recientemente, un estudio reportó una tasa de detección del 5% para la gripe en el EBC [15] ; esto se encuentra en el mismo rango de la tasa de detección que reportamos para virus respiratorios en general; otros estudios con un número limitado de pacientes, describen una sensibilidad marcadamente mayor del 33 al 36% [12] [13] [14] pero el mayor porcentaje puede deberse al bajo número de sujetos participantes [12]. Las máscaras faciales consisten en electret que atrapan virus a base de fibras permanentemente cargadas [13]. Además, el filtro de Teflon tiene 2 μm poros que retienen todas las partículas más grandes. Posiblemente, la menor tasa de detección puede explicarse en parte por el hecho de que el RTubeTM está fabricado en polipropileno y no posee una característica de atracción y filtrado de virus como los materiales mencionados. El qRT-PCR desarrollado por Lu y colaboradores para la detección de RV, no permitió la evaluación de la carga viral presente en las muestras de EBC [10]. También para 4 NS, el título viral permaneció indeterminado, probablemente debido a la sensibilidad limitada del ensayo. Para el diagnóstico, podrían ser necesarios métodos más sensibles para detectar virus respiratorios presentes en EBC, ya que es impredecible cómo se diluyen las partículas virales en el espécimen. Recientemente, se han desarrollado ensayos de qRT-PCR anidados para permitir una detección más sensible de virus en aerosoles [16]. También se ha sugerido que los factores dependientes de la persona, como el número de partículas producidas, el volumen exhalado y la edad del paciente, desempeñan un papel importante para la exhalación de partículas virales. Los participantes que fueron reclutados en el estudio de Fabian y compañeros de trabajo tenían 12 años de edad y más [12]. Para los niños hospitalizados se reporta una tasa mucho más alta de muestras positivas del virus [14]. En nuestro estudio, la mayoría de los voluntarios tenían entre 20 y 30 años de edad. Sólo se incluyeron dos niños menores de 10 años y 3 ancianos (> 70 años de edad). Uno de los niños dio positivo para InfA en el NS, pero la infección no fue confirmada en el EBC. Para la gripe, se previó una tasa de generación exhalada de <3,2 a 20 copias de ARN de gripe por minuto, cuantificando los aerosoles del virus que impactaron en un filtro extraíble de Teflon de una máscara de recolección [12]. Utilizamos el RTubeTM en combinación con el ECoVent, que permitió el registro de parámetros de ventilación adicionales como frecuencia respiratoria y volumen exhalado. De esta manera, cuando se cuantifica el número de copias de ARN en el EBC, se puede estimar la cantidad de partículas virales que se exhalan por litro o por minuto. Lamentablemente, no pudimos predecir una tasa de generación de virus para InfB ya que la carga viral permaneció indeterminada. Aunque un método innovador, nuevo y prometedor, el EBC recogido por el RTubeTM no parece apropiado para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Esta técnica también confirma la observación de que los virus son capaces de diseminarse a través de la respiración normal, particularmente RV. Además, se puede investigar más a fondo la recolección de glóbulos rojos de los pacientes durante las infecciones respiratorias para determinar los patrones de biomarcadores. En terneros infectados experimentalmente con VRS bovina, se observó un aumento en el leucotrieno B 4, lo que indica estrés oxidativo; este aumento también se asoció con el desarrollo de hiperrespuesta bronquial [17]. En humanos, se observó un nivel de H 2 O 2 transitoriamente elevado durante la infección por resfriado común; este marcador volvió a los valores basales cuando los voluntarios se recuperaron de la infección; H 2 O 2 también ha sido reconocido como un marcador interesante en asma, donde se asocia con inflamación crónica de las vías respiratorias inferiores [18]. En voluntarios infectados por InfA, se observó un aumento del CO durante la infección respiratoria Esta observación podría implicar que el CO es un indicador de inflamación de la vía aérea o representa uno de los mecanismos de defensa del huésped contra la infección viral [19]. Por lo tanto, una mejor identificación de la firma del biomarcador en condensados de individuos que experimentan una infección viral podría implicar hallazgos interesantes hacia la identificación de marcadores que reflejan la inflamación o protección antiviral, lo que puede contribuir a los perfiles de biomarcadores establecidos para enfermedades como asma y EPOC, para las cuales se sugiere que las infecciones virales desencadenan o exacerban síntomas [20].
|
¿Cuál fue la conclusión de este estudio?
| false
| 5,195
|
{
"text": [
"EBC collection using the RTube™ is not reliable for diagnosis of respiratory infections"
],
"answer_start": [
1673
]
}
|
La colección de EBC utilizando el RTubeTM no es confiable para el diagnóstico de infecciones respiratorias
|
1,582
|
El muestreo de condensados respiratorios exhalados no es un nuevo método para la detección de virus respiratorioshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3059288/SHA: f3b46e7e8f58799207cc44515f859c1daf5e4dfcAutores: Houspie, Lieselot; De Coster, Sarah; Keyaerts, Els; Narongsack, Phouthalack; De Roy, Rikka; Talboom, Ive; Sisk, Maura; Maes, Piet; Verbeeck, Jannick; Van Ranst, MarcFecha: 2011-03-04DOI: 10.1186/1743-422x-8-98Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRADO: El muestreo MÉTODOS: En nuestro estudio se reclutaron 102 voluntarios con infección de la vía aérea superior durante el invierno y principios de la primavera de 2008/2009 y la primera mitad del invierno de 2009/2010. Se obtuvieron con éxito 99 EBCs y se examinaron 14 virus respiratorios de circulación frecuente. Para investigar la eficiencia del aislamiento del virus del EBC, se tomó un hisopo nasal en paralelo de un subconjunto de voluntarios. El uso combinado del dispositivo ECoVent con el RTubeTM permitió registrar el volumen exhalado y la frecuencia respiratoria durante la recolección. De esta manera, se puede estimar teóricamente el número de partículas virales exhaladas por litro de aire o por minuto. RESULTADOS: El cribado viral resultó en la detección de 4 virus diferentes en EBC y/o hisopos nasales: Rhinovirus, Virus Sincitial Respiratorio Humano B, Influenza A e Influenza B. Rhinovirus fue detectado en 6 EBCs y 1 EBC fue Influenza B positivo. Se reporta una tasa de detección viral del 7% para los EBCs, que es mucho menor que la tasa de detección del 46,8% observada con hisopos nasales. CONCLUSIÓN: Aunque muy prometedora, la recolección de EBC utilizando el RPubeTM no es confiable para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Texto: Las infecciones del tracto respiratorio humano representan las infecciones más frecuentemente encontradas en todo el mundo. En la mayoría de los casos, la etiología de estas infecciones sigue siendo indeterminada debido a la rápida convalecencia después de la infección. Las infecciones del tracto respiratorio en adultos sanos pueden ser causadas por una variedad de patógenos y la detección de estos agentes se basa actualmente en su aislamiento de hisopos nasales (NS), lavados broncoalveolares (BAL), aspirados nasofaríngeos y muestras de esputo. La adquisición de estos especímenes mediante técnicas semi-invasoras e invasivas es a menudo desagradable para el paciente. Por lo tanto, el análisis de condensado de aliento exhalado (EBC) se ha explorado recientemente como un método nuevo y no invasivo para monitorear la inflamación pulmonar y la enfermedad pulmonar como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, fibrosis quística, cáncer de pulmón, etc. Los CEM consisten principalmente en vapor de agua, pero una pequeña fracción contiene gotitas respiratorias derivadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias [1, 2]. Esta observación ha generado un creciente interés en el uso de EBC como nuevo método de muestreo para el cribado de virus respiratorios que infectan las vías aéreas superiores. Al principio, los investigadores sospecharon que la turbulencia del aire inhalado era responsable de la aerosolización del líquido respiratorio. Sin embargo, el efecto del flujo turbulento de aire se limita a las vías aéreas superiores, ya que el flujo turbulento de aire se vuelve laminar a medida que llega a las vías aéreas bronquiales más pequeñas y los alvéolos. Recientemente, se ha descrito el modelo de explosión de la película de líquido bronquiol [3]. Este modelo sugiere que los aerosoles se producen durante la inhalación por el estallido de burbujas de líquido presentes en los bronquiolos. El objetivo de este estudio fue investigar si el método de recolección de EBC fue adecuado para la condensación eficiente de partículas de virus aerosolizados durante la respiración normal En este estudio, se recogieron 102 EBC de voluntarios sanos que mostraban síntomas respiratorios o gripales (definidos en la Tabla 1), utilizando un condensador disponible comercialmente (RTubeTM, Respiratory Research Inc., Charlottesville, Virginia, EE.UU.). Se instruyó al paciente a respirar por vía oral a volúmenes de mareas en una boquilla conectada a un condensador durante 10 minutos. No se utilizaron clips nasales durante la recolección y se evitó la contaminación salival por la presencia de una válvula de un solo sentido y la sección en forma de T de la boquilla. En una primera parte del estudio que se inició durante el invierno y la primavera de 2008/2009, se recogieron 70 muestras de EBC de pacientes que voluntariamente se presentaron a nuestro laboratorio. La mayoría de estos voluntarios fueron estudiantes que respondieron al folleto informativo, distribuido en los edificios universitarios de la Universidad Católica de Leuven. En el otoño y la primera mitad del invierno de 2009/2010, se recogieron 32 condensados de pacientes que se presentaron a su médico general. Debido a circunstancias prácticas, los condensados se recolectaron con el refrigerador refrigerado a -20°C. Para 13 de las 32 colecciones, el RUBETM fue conectado por un conector hecho a medida al ECoVent (Jaeger, Alemania). Este dispositivo registra parámetros ventilatorios como el volumen exhalado, la frecuencia respiratoria y el volumen de mareas. Además, se obtuvo un NS en paralelo con la colección de condensados de cada paciente. Todos los EBC se almacenaron inmediatamente a -20°C. Se refrigeraron los hisopos nasales (NS). Después de la extracción de ADN y ARN virales, se almacenaron muestras de EBC y toallitas nasales a -80°C. Se excluyeron del estudio tres especímenes por recolección incorrecta de condensados, se utilizó un breve cuestionario para documentar la fecha de nacimiento, la gravedad de las dolencias respiratorias y para registrar los días de enfermedad sintomática de todos los voluntarios, el cual fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Universitario de Lovaina y se recibieron consentimientos informados de todos los participantes, se aislaron ADN y ARN virales con el kit de virus QIAamp MinElute (Qiagen, Westburg, Países Bajos) de acuerdo con el manual de instrucciones, se eludieron extractos de EBC en tampón de elución de 60 μl y extractos de NS en tampón de 110 μl. Los condensados respiratorios fueron analizados para detectar 11 virus del ARN respiratorio (CoV NL63, E229 y OC43, RV, HMPV, InfA&B y PIV1-4) [4] [5] [6] [7] utilizando un kit de RCR-RT de OneStep (Qiagen, Westburg, Países Bajos) en una reacción de 50 μl que contenía 10 μl de ARN extraído, 0,6 μM de imprimaciones hacia adelante e inversas (Tabla 2), 1,5 μl de Enzima de One Step, 10 μl 5 × Un tampón de RT-PCR de One Step y 400 μM de cada dNTP. Para el cribado de adenovirus, se realizó un PCR de ADN para el cual la mezcla de reacción de amplificación contenía 0,5 μM de imprimación delantera (AdFW) e imprimación inversa (AdRV), 0,4 mM dNTPs, 10 μl Buffer C y 1 U Taq polimerasa en un volumen final de 50 μl. Los imprimadores PCR utilizados se localizaron en regiones conservadas de los genomas de los patógenos respiratorios (Tabla 2 ). Las reacciones se realizaron en un Termociclista T3000 48 (Westburg, Leusden, Países Bajos) con un paso inicial de transcripción inversa para virus ARN a 50 °C durante 30 min, seguido de activación PCR a 95 °C durante 30 s, 45 ciclos de amplificación seguidos de un paso final de extensión durante 10 min a 72 °C. El programa de amplificación del ADN se inició con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 3 minutos, seguido de 45 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Los amplicones fueron sometidos a un gel de poliacrilamida del 6% y visualizados bajo luz UV por tinción con bromuro de etidium. Los productos PCR fueron purificados utilizando el Kit Invitado MSB Spin PCRapace y el ciclo secuenciado en dirección delantera e inversa utilizando el kit de secuenciación de ciclos de terminación de Big-Dye ABI PRISM (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, USA). El análisis de secuencias se realizó con el Analizador Genético ABI3130 (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, EE.UU En resumen, se preparó una mezcla múltiplex en un volumen final de 25 μl utilizando ARN extraído de 5 μl, 12,5 μl de Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR Master Mix que contiene ROX como referencia pasiva, 0,125 μl Euroscript + RT & Rnasa inhibidor (Eurogentec, Seraing, Bélgica) 200 nM de HRSV-A y -B imprimadores delanteros e inversos específicos y 100 nM de HRSV-A y -B MGB. Los estándares de ARNc se construyeron utilizando el kit T7 de shortscript MEGA (Ambión, Austin, TX, EE.UU.) y cuantificado espectrométricamente. La carga viral de muestras positivas de RV fue cuantificada por qRT-PCR como se describe en el manuscrito publicado por Lu y compañeros [10]. El kit Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR fue utilizado para la preparación de la mezcla maestra como se describe anteriormente. El primer HRSV-AF F 669-695 ctgtgatagarttcaacaaaagaaca [8, 9] HRSV-AF F 718-745 agttacaccttcattaactaaatcc [8, 9] HRSV-BN N 435-458 ggctccagaatatagggattc [8, 9] HRSV-BN N 480-508 tggttattacaagaagagcactacagagt [8, 9] MGB sondas y sondas, situadas en 5'UTR, se añadieron a una concentración final de 1 μM y 0,1 μM, respectivamente. Los estándares de ARNc se construyeron sobre la base del producto PCR de la muestra 1 utilizando el kit MegaScript (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). La cuantificación se realizó con un espectrofotómetro a 260 nm y se convirtió al número de molécula [11]. Se realizaron diluciones en serie de diez veces, lo que permitió la detección en un rango de 8,6 × 10 6 a 8,6 × 10 2 copias de ARN. Los ensayos RT-PCR se realizaron en un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7500 (Aplicado Biosistemas, Foster City, CA, EE.UU.). Se realizó un paso inicial de transcripción inversa a 48°C durante 30 minutos, seguido de un paso de desnaturalización a 95°C durante 10 minutos. Finalmente, se completó un paso de amplificación de 45 cicli a 95°C durante 15 segundos y 1 min a 60°C. (37,5%) hombres, con mediana de edad de 29 años (rango 9 -46 años). Faltaron edad y género para 2 participantes del segundo Sólo el 6% eran menores de 20 años y el 3% tenían más de 70 años; en total, 80 pacientes (78,4%) ya se encontraban enfermos durante 1 a 7 días en el día de la obtención de la muestra; siete voluntarios (6,8%) eran sintomáticos durante 8 a 14 días y 9 participantes (8,8%) ya estaban enfermos durante más de 14 días en el día de la recogida de la muestra; faltaban datos sobre la duración de los síntomas en 6 pacientes; casi todos los voluntarios experimentaron al menos 2 síntomas, excepto en dos pacientes (Tabla 1); cuarenta y siete (46,1%) voluntarios se quejaron de una constante secreción nasal o congestión nasal, 43 (42,2%) tuvieron frecuentes episodios de estornudos y 38 (37,3%) tuvieron dolor de garganta grave (Tabla 1). El cribado de los EBC para 14 virus respiratorios (Tabla 2), mostró 5 muestras positivas de RV (7,1%) (Tabla 3). En una segunda parte, se recolectaron 32 EBC de pacientes que se presentaron a su médico general; dos de estos EBC fueron positivos para uno de los 14 virus respiratorios investigados, 1 para RV y 1 para InfB. Para inspeccionar la tasa de detección de virus respiratorios en el condensado, se tomó un NS de este segundo grupo de voluntarios para la comparación. En 15 de los 32 NS (46,8%), uno o más patógenos virales fueron aislados. El cribado viral del NS resultó en la detección de RV, InfA (subtipo H1N1) y HRSV-B. La cuantificación de la carga viral HRSV-B demostrada para las muestras 72 y 101 títulos virales de 8,0 × 10 4 copias de ARN/ml y 6,8 × 10 7 copias de ARN/ml respectivamente. El ensayo RV RT-PCR no permitió la cuantificación de todas las muestras que dieron positivo para RV por PCR (Tabla 3). La presencia del mismo patógeno tanto en el EBC como en el NS fue confirmada para una sola muestra: muestra 71, que dio positivo para RV tanto en el EBC como en el NS. Para la muestra 81, se detectó RV en el NS y el análisis del EBC demostró una infección por InfB. Para las muestras de EBC que fueron recogidas en otoño e invierno de 2009/2010, las mediciones con el EcoVent en (Tabla 3, muestra 81) fueron positivas para InfB cuando se utilizó el RTube En teoría, la tasa de generación viral (número de copias de ARN viral exhaladas por minuto) se puede predecir mediante la cuantificación de la carga viral exhalada. Luego, se puede calcular una estimación de las copias de ARN por litro de aire exhalado o por minuto. La cuantificación del InfB exhalado nos permitiría predecir la tasa de generación de este virus. Debido a un volumen de muestra insuficiente, no pudimos determinar el número de copias de ARN en la muestra. La recolección de condensados de aliento exhalados es un método novedoso y no invasivo para obtener muestras del tracto respiratorio superior. La recolección de EBC es fácil de realizar y se puede llevar a cabo en un ambiente doméstico. Este método es mucho más agradable para el paciente cuando se compara con la recolección desagradable e invasiva de hisopos nasales, BAL, aspirados, etc. Este aspecto hace que el método sea muy atractivo para diagnósticos de laboratorio rutina La mayoría de los estudios que realizan análisis de aliento para la detección viral utilizan máscaras faciales modificadas, con una región central extraíble en electret o un filtro de teflón extraíble en el que las partículas exhaladas impactan [12] [13] [14]. Con el dispositivo de recolección de RTubeTM, las partículas aerosolizadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias se precipitan en un condensado cuando se enfría la respiración, lo que sirve como punto de partida inmediato para las pruebas moleculares. Hasta ahora, este es el estudio con el subconjunto más grande de voluntarios que investigó la EBC como muestra para la detección de virus respiratorios. Estudios anteriores reportaron la inclusión de un subconjunto limitado de participantes e investigaron la presencia de un número limitado de virus en las muestras de aliento. El estudio realizado por Fabian y colegas, incluyó 12 voluntarios [12]. Huynh y compañeros de trabajo reclutaron a 9 voluntarios En el estudio de Stelzer-Braid et al., se analizaron 50 EBCs [14] y St-George et al. reportaron la participación de 12 adultos [15]. Estos estudios se han centrado en la detección de InfA y -B, PIV1-3, HRSV y HMPV, mientras que hemos examinado las muestras para un panel de 14 virus respiratorios que circulan comúnmente. Basados en el análisis de 99 EBCs (3 EBCs fueron excluidos), nuestros resultados apoyan la exhalación de RV e InfB en el 7% de nuestras muestras. Dado que muchos de los voluntarios ya habían estado experimentando síntomas durante 1 a 7 días, inicialmente presumimos que ya se estaban recuperando de la infección y ya no estaban exhalando el virus. Sin embargo, en una segunda parte de nuestro estudio comenzamos a recolectar los CNE en paralelo con hisopos nasales de pacientes que se presentaban a su médico, 1 a 3 días después de la aparición de los síntomas; sólo se detectó 1 condensado del mismo patógeno tanto en el CNE como en el NS; la tasa de detección de patógenos virales respiratorios en el NS fue de 46,8%, muy superior a la tasa de detección del 7% en los CNE; por lo tanto, la baja detección de condensados positivos del virus no se puede atribuir al hecho de que los voluntarios ya no eran infecciosos; la tasa de detección discrepante entre muestras también puede explicarse por la diferente gravedad de la infección respiratoria, ya que las muestras de comparador eran de diferentes partes del tracto respiratorio; los pacientes que presentaron un NS positivo podrían haber sufrido una infección de vía aérea superior, mientras que los voluntarios positivos del CNE pueden haber Sin embargo, no se investigó el efecto de la inhalación nasal en la recolección de CNE, guiando partículas formadas en el tracto respiratorio superior a los compartimentos inferiores, en lugar de la inhalación oral, los pacientes con muestras positivas de CNE experimentaron síntomas durante un máximo de dos días en el momento de la recolección, sin embargo, esto no fue diferente en 7 pacientes con SNE positivo. Seis pacientes que proporcionaron SNE positivo experimentaron síntomas durante un período más largo en el momento de la recolección (Tabla 3 ). En el grupo de voluntarios que proporcionaron una muestra de CNE negativo o CNE y SNE negativo, la manifestación de síntomas fue reportada de 1 día a más de dos semanas. Cuando se compararon los síntomas reportados entre los pacientes positivos de CNE (7) y los pacientes positivos de SNE (15), el 27% y el 33% en el grupo positivo de SNE experimentaron escalofríos y dolor muscular En todos los grupos se reportaron fiebre, cefalea, ojos llorosos, nariz rellena, estornudos frecuentes, dolor de garganta y tos; no se diagnosticó a los voluntarios con otros patógenos antes de la participación en el estudio; ya que no probamos estas muestras para otros que no sean patógenos virales, no podemos excluir la posibilidad de que algunos de los NS negativos sean positivos para bacterias u otros patógenos causantes de enfermedades respiratorias; recientemente, un estudio reportó una tasa de detección del 5% para la gripe en el EBC [15] ; esto se encuentra en el mismo rango de la tasa de detección que reportamos para virus respiratorios en general; otros estudios con un número limitado de pacientes, describen una sensibilidad marcadamente mayor del 33 al 36% [12] [13] [14] pero el mayor porcentaje puede deberse al bajo número de sujetos participantes [12]. Las máscaras faciales consisten en electret que atrapan virus a base de fibras permanentemente cargadas [13]. Además, el filtro de Teflon tiene 2 μm poros que retienen todas las partículas más grandes. Posiblemente, la menor tasa de detección puede explicarse en parte por el hecho de que el RTubeTM está fabricado en polipropileno y no posee una característica de atracción y filtrado de virus como los materiales mencionados. El qRT-PCR desarrollado por Lu y colaboradores para la detección de RV, no permitió la evaluación de la carga viral presente en las muestras de EBC [10]. También para 4 NS, el título viral permaneció indeterminado, probablemente debido a la sensibilidad limitada del ensayo. Para el diagnóstico, podrían ser necesarios métodos más sensibles para detectar virus respiratorios presentes en EBC, ya que es impredecible cómo se diluyen las partículas virales en el espécimen. Recientemente, se han desarrollado ensayos de qRT-PCR anidados para permitir una detección más sensible de virus en aerosoles [16]. También se ha sugerido que los factores dependientes de la persona, como el número de partículas producidas, el volumen exhalado y la edad del paciente, desempeñan un papel importante para la exhalación de partículas virales. Los participantes que fueron reclutados en el estudio de Fabian y compañeros de trabajo tenían 12 años de edad y más [12]. Para los niños hospitalizados se reporta una tasa mucho más alta de muestras positivas del virus [14]. En nuestro estudio, la mayoría de los voluntarios tenían entre 20 y 30 años de edad. Sólo se incluyeron dos niños menores de 10 años y 3 ancianos (> 70 años de edad). Uno de los niños dio positivo para InfA en el NS, pero la infección no fue confirmada en el EBC. Para la gripe, se previó una tasa de generación exhalada de <3,2 a 20 copias de ARN de gripe por minuto, cuantificando los aerosoles del virus que impactaron en un filtro extraíble de Teflon de una máscara de recolección [12]. Utilizamos el RTubeTM en combinación con el ECoVent, que permitió el registro de parámetros de ventilación adicionales como frecuencia respiratoria y volumen exhalado. De esta manera, cuando se cuantifica el número de copias de ARN en el EBC, se puede estimar la cantidad de partículas virales que se exhalan por litro o por minuto. Lamentablemente, no pudimos predecir una tasa de generación de virus para InfB ya que la carga viral permaneció indeterminada. Aunque un método innovador, nuevo y prometedor, el EBC recogido por el RTubeTM no parece apropiado para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Esta técnica también confirma la observación de que los virus son capaces de diseminarse a través de la respiración normal, particularmente RV. Además, se puede investigar más a fondo la recolección de glóbulos rojos de los pacientes durante las infecciones respiratorias para determinar los patrones de biomarcadores. En terneros infectados experimentalmente con VRS bovina, se observó un aumento en el leucotrieno B 4, lo que indica estrés oxidativo; este aumento también se asoció con el desarrollo de hiperrespuesta bronquial [17]. En humanos, se observó un nivel de H 2 O 2 transitoriamente elevado durante la infección por resfriado común; este marcador volvió a los valores basales cuando los voluntarios se recuperaron de la infección; H 2 O 2 también ha sido reconocido como un marcador interesante en asma, donde se asocia con inflamación crónica de las vías respiratorias inferiores [18]. En voluntarios infectados por InfA, se observó un aumento del CO durante la infección respiratoria Esta observación podría implicar que el CO es un indicador de inflamación de la vía aérea o representa uno de los mecanismos de defensa del huésped contra la infección viral [19]. Por lo tanto, una mejor identificación de la firma del biomarcador en condensados de individuos que experimentan una infección viral podría implicar hallazgos interesantes hacia la identificación de marcadores que reflejan la inflamación o protección antiviral, lo que puede contribuir a los perfiles de biomarcadores establecidos para enfermedades como asma y EPOC, para las cuales se sugiere que las infecciones virales desencadenan o exacerban síntomas [20].
|
¿Cuánto tiempo inhaló el paciente en el RTube?
| false
| 5,196
|
{
"text": [
"10 minutes"
],
"answer_start": [
4107
]
}
|
10 minutos
|
1,582
|
El muestreo de condensados respiratorios exhalados no es un nuevo método para la detección de virus respiratorioshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3059288/SHA: f3b46e7e8f58799207cc44515f859c1daf5e4dfcAutores: Houspie, Lieselot; De Coster, Sarah; Keyaerts, Els; Narongsack, Phouthalack; De Roy, Rikka; Talboom, Ive; Sisk, Maura; Maes, Piet; Verbeeck, Jannick; Van Ranst, MarcFecha: 2011-03-04DOI: 10.1186/1743-422x-8-98Licencia: cc-byAbstract: ANTEGRADO: El muestreo MÉTODOS: En nuestro estudio se reclutaron 102 voluntarios con infección de la vía aérea superior durante el invierno y principios de la primavera de 2008/2009 y la primera mitad del invierno de 2009/2010. Se obtuvieron con éxito 99 EBCs y se examinaron 14 virus respiratorios de circulación frecuente. Para investigar la eficiencia del aislamiento del virus del EBC, se tomó un hisopo nasal en paralelo de un subconjunto de voluntarios. El uso combinado del dispositivo ECoVent con el RTubeTM permitió registrar el volumen exhalado y la frecuencia respiratoria durante la recolección. De esta manera, se puede estimar teóricamente el número de partículas virales exhaladas por litro de aire o por minuto. RESULTADOS: El cribado viral resultó en la detección de 4 virus diferentes en EBC y/o hisopos nasales: Rhinovirus, Virus Sincitial Respiratorio Humano B, Influenza A e Influenza B. Rhinovirus fue detectado en 6 EBCs y 1 EBC fue Influenza B positivo. Se reporta una tasa de detección viral del 7% para los EBCs, que es mucho menor que la tasa de detección del 46,8% observada con hisopos nasales. CONCLUSIÓN: Aunque muy prometedora, la recolección de EBC utilizando el RPubeTM no es confiable para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Texto: Las infecciones del tracto respiratorio humano representan las infecciones más frecuentemente encontradas en todo el mundo. En la mayoría de los casos, la etiología de estas infecciones sigue siendo indeterminada debido a la rápida convalecencia después de la infección. Las infecciones del tracto respiratorio en adultos sanos pueden ser causadas por una variedad de patógenos y la detección de estos agentes se basa actualmente en su aislamiento de hisopos nasales (NS), lavados broncoalveolares (BAL), aspirados nasofaríngeos y muestras de esputo. La adquisición de estos especímenes mediante técnicas semi-invasoras e invasivas es a menudo desagradable para el paciente. Por lo tanto, el análisis de condensado de aliento exhalado (EBC) se ha explorado recientemente como un método nuevo y no invasivo para monitorear la inflamación pulmonar y la enfermedad pulmonar como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, fibrosis quística, cáncer de pulmón, etc. Los CEM consisten principalmente en vapor de agua, pero una pequeña fracción contiene gotitas respiratorias derivadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias [1, 2]. Esta observación ha generado un creciente interés en el uso de EBC como nuevo método de muestreo para el cribado de virus respiratorios que infectan las vías aéreas superiores. Al principio, los investigadores sospecharon que la turbulencia del aire inhalado era responsable de la aerosolización del líquido respiratorio. Sin embargo, el efecto del flujo turbulento de aire se limita a las vías aéreas superiores, ya que el flujo turbulento de aire se vuelve laminar a medida que llega a las vías aéreas bronquiales más pequeñas y los alvéolos. Recientemente, se ha descrito el modelo de explosión de la película de líquido bronquiol [3]. Este modelo sugiere que los aerosoles se producen durante la inhalación por el estallido de burbujas de líquido presentes en los bronquiolos. El objetivo de este estudio fue investigar si el método de recolección de EBC fue adecuado para la condensación eficiente de partículas de virus aerosolizados durante la respiración normal En este estudio, se recogieron 102 EBC de voluntarios sanos que mostraban síntomas respiratorios o gripales (definidos en la Tabla 1), utilizando un condensador disponible comercialmente (RTubeTM, Respiratory Research Inc., Charlottesville, Virginia, EE.UU.). Se instruyó al paciente a respirar por vía oral a volúmenes de mareas en una boquilla conectada a un condensador durante 10 minutos. No se utilizaron clips nasales durante la recolección y se evitó la contaminación salival por la presencia de una válvula de un solo sentido y la sección en forma de T de la boquilla. En una primera parte del estudio que se inició durante el invierno y la primavera de 2008/2009, se recogieron 70 muestras de EBC de pacientes que voluntariamente se presentaron a nuestro laboratorio. La mayoría de estos voluntarios fueron estudiantes que respondieron al folleto informativo, distribuido en los edificios universitarios de la Universidad Católica de Leuven. En el otoño y la primera mitad del invierno de 2009/2010, se recogieron 32 condensados de pacientes que se presentaron a su médico general. Debido a circunstancias prácticas, los condensados se recolectaron con el refrigerador refrigerado a -20°C. Para 13 de las 32 colecciones, el RUBETM fue conectado por un conector hecho a medida al ECoVent (Jaeger, Alemania). Este dispositivo registra parámetros ventilatorios como el volumen exhalado, la frecuencia respiratoria y el volumen de mareas. Además, se obtuvo un NS en paralelo con la colección de condensados de cada paciente. Todos los EBC se almacenaron inmediatamente a -20°C. Se refrigeraron los hisopos nasales (NS). Después de la extracción de ADN y ARN virales, se almacenaron muestras de EBC y toallitas nasales a -80°C. Se excluyeron del estudio tres especímenes por recolección incorrecta de condensados, se utilizó un breve cuestionario para documentar la fecha de nacimiento, la gravedad de las dolencias respiratorias y para registrar los días de enfermedad sintomática de todos los voluntarios, el cual fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Universitario de Lovaina y se recibieron consentimientos informados de todos los participantes, se aislaron ADN y ARN virales con el kit de virus QIAamp MinElute (Qiagen, Westburg, Países Bajos) de acuerdo con el manual de instrucciones, se eludieron extractos de EBC en tampón de elución de 60 μl y extractos de NS en tampón de 110 μl. Los condensados respiratorios fueron analizados para detectar 11 virus del ARN respiratorio (CoV NL63, E229 y OC43, RV, HMPV, InfA&B y PIV1-4) [4] [5] [6] [7] utilizando un kit de RCR-RT de OneStep (Qiagen, Westburg, Países Bajos) en una reacción de 50 μl que contenía 10 μl de ARN extraído, 0,6 μM de imprimaciones hacia adelante e inversas (Tabla 2), 1,5 μl de Enzima de One Step, 10 μl 5 × Un tampón de RT-PCR de One Step y 400 μM de cada dNTP. Para el cribado de adenovirus, se realizó un PCR de ADN para el cual la mezcla de reacción de amplificación contenía 0,5 μM de imprimación delantera (AdFW) e imprimación inversa (AdRV), 0,4 mM dNTPs, 10 μl Buffer C y 1 U Taq polimerasa en un volumen final de 50 μl. Los imprimadores PCR utilizados se localizaron en regiones conservadas de los genomas de los patógenos respiratorios (Tabla 2 ). Las reacciones se realizaron en un Termociclista T3000 48 (Westburg, Leusden, Países Bajos) con un paso inicial de transcripción inversa para virus ARN a 50 °C durante 30 min, seguido de activación PCR a 95 °C durante 30 s, 45 ciclos de amplificación seguidos de un paso final de extensión durante 10 min a 72 °C. El programa de amplificación del ADN se inició con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 3 minutos, seguido de 45 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Los amplicones fueron sometidos a un gel de poliacrilamida del 6% y visualizados bajo luz UV por tinción con bromuro de etidium. Los productos PCR fueron purificados utilizando el Kit Invitado MSB Spin PCRapace y el ciclo secuenciado en dirección delantera e inversa utilizando el kit de secuenciación de ciclos de terminación de Big-Dye ABI PRISM (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, USA). El análisis de secuencias se realizó con el Analizador Genético ABI3130 (Aplicado Biosystems, Foster City, CA, EE.UU En resumen, se preparó una mezcla múltiplex en un volumen final de 25 μl utilizando ARN extraído de 5 μl, 12,5 μl de Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR Master Mix que contiene ROX como referencia pasiva, 0,125 μl Euroscript + RT & Rnasa inhibidor (Eurogentec, Seraing, Bélgica) 200 nM de HRSV-A y -B imprimadores delanteros e inversos específicos y 100 nM de HRSV-A y -B MGB. Los estándares de ARNc se construyeron utilizando el kit T7 de shortscript MEGA (Ambión, Austin, TX, EE.UU.) y cuantificado espectrométricamente. La carga viral de muestras positivas de RV fue cuantificada por qRT-PCR como se describe en el manuscrito publicado por Lu y compañeros [10]. El kit Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR fue utilizado para la preparación de la mezcla maestra como se describe anteriormente. El primer HRSV-AF F 669-695 ctgtgatagarttcaacaaaagaaca [8, 9] HRSV-AF F 718-745 agttacaccttcattaactaaatcc [8, 9] HRSV-BN N 435-458 ggctccagaatatagggattc [8, 9] HRSV-BN N 480-508 tggttattacaagaagagcactacagagt [8, 9] MGB sondas y sondas, situadas en 5'UTR, se añadieron a una concentración final de 1 μM y 0,1 μM, respectivamente. Los estándares de ARNc se construyeron sobre la base del producto PCR de la muestra 1 utilizando el kit MegaScript (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). La cuantificación se realizó con un espectrofotómetro a 260 nm y se convirtió al número de molécula [11]. Se realizaron diluciones en serie de diez veces, lo que permitió la detección en un rango de 8,6 × 10 6 a 8,6 × 10 2 copias de ARN. Los ensayos RT-PCR se realizaron en un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7500 (Aplicado Biosistemas, Foster City, CA, EE.UU.). Se realizó un paso inicial de transcripción inversa a 48°C durante 30 minutos, seguido de un paso de desnaturalización a 95°C durante 10 minutos. Finalmente, se completó un paso de amplificación de 45 cicli a 95°C durante 15 segundos y 1 min a 60°C. (37,5%) hombres, con mediana de edad de 29 años (rango 9 -46 años). Faltaron edad y género para 2 participantes del segundo Sólo el 6% eran menores de 20 años y el 3% tenían más de 70 años; en total, 80 pacientes (78,4%) ya se encontraban enfermos durante 1 a 7 días en el día de la obtención de la muestra; siete voluntarios (6,8%) eran sintomáticos durante 8 a 14 días y 9 participantes (8,8%) ya estaban enfermos durante más de 14 días en el día de la recogida de la muestra; faltaban datos sobre la duración de los síntomas en 6 pacientes; casi todos los voluntarios experimentaron al menos 2 síntomas, excepto en dos pacientes (Tabla 1); cuarenta y siete (46,1%) voluntarios se quejaron de una constante secreción nasal o congestión nasal, 43 (42,2%) tuvieron frecuentes episodios de estornudos y 38 (37,3%) tuvieron dolor de garganta grave (Tabla 1). El cribado de los EBC para 14 virus respiratorios (Tabla 2), mostró 5 muestras positivas de RV (7,1%) (Tabla 3). En una segunda parte, se recolectaron 32 EBC de pacientes que se presentaron a su médico general; dos de estos EBC fueron positivos para uno de los 14 virus respiratorios investigados, 1 para RV y 1 para InfB. Para inspeccionar la tasa de detección de virus respiratorios en el condensado, se tomó un NS de este segundo grupo de voluntarios para la comparación. En 15 de los 32 NS (46,8%), uno o más patógenos virales fueron aislados. El cribado viral del NS resultó en la detección de RV, InfA (subtipo H1N1) y HRSV-B. La cuantificación de la carga viral HRSV-B demostrada para las muestras 72 y 101 títulos virales de 8,0 × 10 4 copias de ARN/ml y 6,8 × 10 7 copias de ARN/ml respectivamente. El ensayo RV RT-PCR no permitió la cuantificación de todas las muestras que dieron positivo para RV por PCR (Tabla 3). La presencia del mismo patógeno tanto en el EBC como en el NS fue confirmada para una sola muestra: muestra 71, que dio positivo para RV tanto en el EBC como en el NS. Para la muestra 81, se detectó RV en el NS y el análisis del EBC demostró una infección por InfB. Para las muestras de EBC que fueron recogidas en otoño e invierno de 2009/2010, las mediciones con el EcoVent en (Tabla 3, muestra 81) fueron positivas para InfB cuando se utilizó el RTube En teoría, la tasa de generación viral (número de copias de ARN viral exhaladas por minuto) se puede predecir mediante la cuantificación de la carga viral exhalada. Luego, se puede calcular una estimación de las copias de ARN por litro de aire exhalado o por minuto. La cuantificación del InfB exhalado nos permitiría predecir la tasa de generación de este virus. Debido a un volumen de muestra insuficiente, no pudimos determinar el número de copias de ARN en la muestra. La recolección de condensados de aliento exhalados es un método novedoso y no invasivo para obtener muestras del tracto respiratorio superior. La recolección de EBC es fácil de realizar y se puede llevar a cabo en un ambiente doméstico. Este método es mucho más agradable para el paciente cuando se compara con la recolección desagradable e invasiva de hisopos nasales, BAL, aspirados, etc. Este aspecto hace que el método sea muy atractivo para diagnósticos de laboratorio rutina La mayoría de los estudios que realizan análisis de aliento para la detección viral utilizan máscaras faciales modificadas, con una región central extraíble en electret o un filtro de teflón extraíble en el que las partículas exhaladas impactan [12] [13] [14]. Con el dispositivo de recolección de RTubeTM, las partículas aerosolizadas del líquido de revestimiento de las vías respiratorias se precipitan en un condensado cuando se enfría la respiración, lo que sirve como punto de partida inmediato para las pruebas moleculares. Hasta ahora, este es el estudio con el subconjunto más grande de voluntarios que investigó la EBC como muestra para la detección de virus respiratorios. Estudios anteriores reportaron la inclusión de un subconjunto limitado de participantes e investigaron la presencia de un número limitado de virus en las muestras de aliento. El estudio realizado por Fabian y colegas, incluyó 12 voluntarios [12]. Huynh y compañeros de trabajo reclutaron a 9 voluntarios En el estudio de Stelzer-Braid et al., se analizaron 50 EBCs [14] y St-George et al. reportaron la participación de 12 adultos [15]. Estos estudios se han centrado en la detección de InfA y -B, PIV1-3, HRSV y HMPV, mientras que hemos examinado las muestras para un panel de 14 virus respiratorios que circulan comúnmente. Basados en el análisis de 99 EBCs (3 EBCs fueron excluidos), nuestros resultados apoyan la exhalación de RV e InfB en el 7% de nuestras muestras. Dado que muchos de los voluntarios ya habían estado experimentando síntomas durante 1 a 7 días, inicialmente presumimos que ya se estaban recuperando de la infección y ya no estaban exhalando el virus. Sin embargo, en una segunda parte de nuestro estudio comenzamos a recolectar los CNE en paralelo con hisopos nasales de pacientes que se presentaban a su médico, 1 a 3 días después de la aparición de los síntomas; sólo se detectó 1 condensado del mismo patógeno tanto en el CNE como en el NS; la tasa de detección de patógenos virales respiratorios en el NS fue de 46,8%, muy superior a la tasa de detección del 7% en los CNE; por lo tanto, la baja detección de condensados positivos del virus no se puede atribuir al hecho de que los voluntarios ya no eran infecciosos; la tasa de detección discrepante entre muestras también puede explicarse por la diferente gravedad de la infección respiratoria, ya que las muestras de comparador eran de diferentes partes del tracto respiratorio; los pacientes que presentaron un NS positivo podrían haber sufrido una infección de vía aérea superior, mientras que los voluntarios positivos del CNE pueden haber Sin embargo, no se investigó el efecto de la inhalación nasal en la recolección de CNE, guiando partículas formadas en el tracto respiratorio superior a los compartimentos inferiores, en lugar de la inhalación oral, los pacientes con muestras positivas de CNE experimentaron síntomas durante un máximo de dos días en el momento de la recolección, sin embargo, esto no fue diferente en 7 pacientes con SNE positivo. Seis pacientes que proporcionaron SNE positivo experimentaron síntomas durante un período más largo en el momento de la recolección (Tabla 3 ). En el grupo de voluntarios que proporcionaron una muestra de CNE negativo o CNE y SNE negativo, la manifestación de síntomas fue reportada de 1 día a más de dos semanas. Cuando se compararon los síntomas reportados entre los pacientes positivos de CNE (7) y los pacientes positivos de SNE (15), el 27% y el 33% en el grupo positivo de SNE experimentaron escalofríos y dolor muscular En todos los grupos se reportaron fiebre, cefalea, ojos llorosos, nariz rellena, estornudos frecuentes, dolor de garganta y tos; no se diagnosticó a los voluntarios con otros patógenos antes de la participación en el estudio; ya que no probamos estas muestras para otros que no sean patógenos virales, no podemos excluir la posibilidad de que algunos de los NS negativos sean positivos para bacterias u otros patógenos causantes de enfermedades respiratorias; recientemente, un estudio reportó una tasa de detección del 5% para la gripe en el EBC [15] ; esto se encuentra en el mismo rango de la tasa de detección que reportamos para virus respiratorios en general; otros estudios con un número limitado de pacientes, describen una sensibilidad marcadamente mayor del 33 al 36% [12] [13] [14] pero el mayor porcentaje puede deberse al bajo número de sujetos participantes [12]. Las máscaras faciales consisten en electret que atrapan virus a base de fibras permanentemente cargadas [13]. Además, el filtro de Teflon tiene 2 μm poros que retienen todas las partículas más grandes. Posiblemente, la menor tasa de detección puede explicarse en parte por el hecho de que el RTubeTM está fabricado en polipropileno y no posee una característica de atracción y filtrado de virus como los materiales mencionados. El qRT-PCR desarrollado por Lu y colaboradores para la detección de RV, no permitió la evaluación de la carga viral presente en las muestras de EBC [10]. También para 4 NS, el título viral permaneció indeterminado, probablemente debido a la sensibilidad limitada del ensayo. Para el diagnóstico, podrían ser necesarios métodos más sensibles para detectar virus respiratorios presentes en EBC, ya que es impredecible cómo se diluyen las partículas virales en el espécimen. Recientemente, se han desarrollado ensayos de qRT-PCR anidados para permitir una detección más sensible de virus en aerosoles [16]. También se ha sugerido que los factores dependientes de la persona, como el número de partículas producidas, el volumen exhalado y la edad del paciente, desempeñan un papel importante para la exhalación de partículas virales. Los participantes que fueron reclutados en el estudio de Fabian y compañeros de trabajo tenían 12 años de edad y más [12]. Para los niños hospitalizados se reporta una tasa mucho más alta de muestras positivas del virus [14]. En nuestro estudio, la mayoría de los voluntarios tenían entre 20 y 30 años de edad. Sólo se incluyeron dos niños menores de 10 años y 3 ancianos (> 70 años de edad). Uno de los niños dio positivo para InfA en el NS, pero la infección no fue confirmada en el EBC. Para la gripe, se previó una tasa de generación exhalada de <3,2 a 20 copias de ARN de gripe por minuto, cuantificando los aerosoles del virus que impactaron en un filtro extraíble de Teflon de una máscara de recolección [12]. Utilizamos el RTubeTM en combinación con el ECoVent, que permitió el registro de parámetros de ventilación adicionales como frecuencia respiratoria y volumen exhalado. De esta manera, cuando se cuantifica el número de copias de ARN en el EBC, se puede estimar la cantidad de partículas virales que se exhalan por litro o por minuto. Lamentablemente, no pudimos predecir una tasa de generación de virus para InfB ya que la carga viral permaneció indeterminada. Aunque un método innovador, nuevo y prometedor, el EBC recogido por el RTubeTM no parece apropiado para el diagnóstico de infecciones respiratorias. Esta técnica también confirma la observación de que los virus son capaces de diseminarse a través de la respiración normal, particularmente RV. Además, se puede investigar más a fondo la recolección de glóbulos rojos de los pacientes durante las infecciones respiratorias para determinar los patrones de biomarcadores. En terneros infectados experimentalmente con VRS bovina, se observó un aumento en el leucotrieno B 4, lo que indica estrés oxidativo; este aumento también se asoció con el desarrollo de hiperrespuesta bronquial [17]. En humanos, se observó un nivel de H 2 O 2 transitoriamente elevado durante la infección por resfriado común; este marcador volvió a los valores basales cuando los voluntarios se recuperaron de la infección; H 2 O 2 también ha sido reconocido como un marcador interesante en asma, donde se asocia con inflamación crónica de las vías respiratorias inferiores [18]. En voluntarios infectados por InfA, se observó un aumento del CO durante la infección respiratoria Esta observación podría implicar que el CO es un indicador de inflamación de la vía aérea o representa uno de los mecanismos de defensa del huésped contra la infección viral [19]. Por lo tanto, una mejor identificación de la firma del biomarcador en condensados de individuos que experimentan una infección viral podría implicar hallazgos interesantes hacia la identificación de marcadores que reflejan la inflamación o protección antiviral, lo que puede contribuir a los perfiles de biomarcadores establecidos para enfermedades como asma y EPOC, para las cuales se sugiere que las infecciones virales desencadenan o exacerban síntomas [20].
|
¿Qué siguió al paso de transcripción inversa en el análisis?
| false
| 5,197
|
{
"text": [
"denaturation step"
],
"answer_start": [
9620
]
}
|
Paso de desnaturalización
|
Subsets and Splits
No community queries yet
The top public SQL queries from the community will appear here once available.